Embden-Meyerhof-Parnasova dráha

Schéma reakcí glykolýzy

Glykolýza (neboli Embden-Meyerhof-Parnasova dráha) je základní metabolický děj probíhající v cytoplazmě všech buněk lidského těla. Řadí se mezi katabolické dráhy. Glykolýzou vznikají z jedné molekuly glukózy dvě tříuhlíkaté molekuly – pyruvát (Pyr) či laktát (Lac). Glykolýza plní mnoho funkcí, například zisk energie či tvorbu acetyl-CoA jako substrátu pro syntézu lipidů.

Glykolýza probíhá jak za aerobních, tak i za anaerobních podmínek. Za aerobních podmínek se vytvářejí dvě molekuly pyruvátu, dvě molekuly ATP a dvě molekuly NADH. Za anaerobních podmínek podléhá pyruvát další reakci, která regeneruje kofaktor NAD⁺ – produktem je pak laktát.

Reakce glykolýzy

Celou glykolýzu můžeme souhrnně zapsat jako rovnici:

Glukóza + 2 NAD⁺ + 2 ADP + 2 P_i → 2 pyruvát + 2 NADH + 2 ATP + 2 H₂O

Glykolýza se dělí do několika fází:

1. Investice energie a současná aktivace molekul glukózy.
2. Štěpení hexózy na dvě triózy.
3. Oxidace trióz a současný zisk energie.
4. Přeměna pyruvátu na laktát (za anaerobních podmínek).

V následujícím přehledu popíšeme její jednotlivé reakce

1. Fosforylace glukózy

1. Fosforylace glukózy

Po vstupu molekul glukózy do buněk dochází k jejich okamžité fosforylaci. Tato reakce přeměňuje neutrální molekulu glukózy na anion. Takto modifikovaná glukóza může být dále metabolizována a současně již neprochází buněčnou membránou. Zachycuje se tedy v cytosolu, kde je dále metabolizována.

Glukóza + ATP → Glc-6-P + ADP

Kromě jedné makroergní vazby molekuly ATP vyžaduje reakce i enzymovou katalýzu zprostředkovanou jedním ze dvou izoenzymů – hexokinázou či glukokinázou.

Glukokináza (neboli hexokináza typu IV) je lokalizována pouze v hepatocytech a v β-buňkách pankreatu, zatímco hexokináza je ve všech tkáních. Kromě lokalizace se liší i ve svých fyzikálně-chemických vlastnostech. Glukokináza má vysokou hodnotu K_M (10 mmol/l), a proto je aktivována až při vyšších koncentracích glukózy. Uplatňuje se převážně po jídle, kdy je koncentrace glukózy v portální krvi vysoká a je zapotřebí ji vychytávat játry (např. pro syntézu glykogenu). β-buňky pankreatu zároveň reagují na vyšší hladiny glykémie zvýšením sekrece inzulinu.

Hexokináza je za fyziologických podmínek vždy téměř plně aktivní, neboť její K_M je pouhých 0,1 mmol/l (srovnej s fyziologickým rozsahem glykémie 3,3–5,6 mmol/l). Její aktivita je tedy regulována jiným mechanismem a tím je inhibice svým vlastním produktem – Glc-6-P. Zjednodušeně se tedy dá říci, že hexokináza produkuje tolik Glc-6-P, kolik je buňka schopna utilizovat ve svých drahách. Jakmile se začne Glc-6-P hromadit, dojde k inhibici hexokinázy. Kromě fosforylace glukózy umožňuje hexokináza i fosforylaci fruktózy.

2. Izomerizace Glc-6-P na Fru-6-P

Izomerizace Glc-6-P na Fru-6-P je reverzibilní reakce probíhající za katalýzy hexosafosfátizomerázou.

2. Izomerizace Glc-6-P na Fru-6-P

3. Fosforylace Fru-6-P za spotřeby ATP na Fru-1,6-bisP

Fosforylaci Fru-6-P na Fru-1,6-bisP katalyzuje enzym 6-fosfofrukto-1-kináza. Jedná se o klíčový allosterický regulační enzym glykolýzy.

V průběhu dosavadních tří kroků došlo k investici dvou molekul ATP na jednu molekulu glukózy.

3. Fosforylace Fru-6-P za spotřeby ATP na Fru-1,6-bisP

4. Aldolové štěpení Fru-1,6-bisP na dvě fosforylované triózy

Fru-1,6-bisP se následně štěpí na dvě fosforylované triózy – glyceraldehyd-3-P (Gra-3-P, aldóza) a dihydroxyaceton-3-P (DHA-3-P, ketóza). Katalýzu zajišťuje aldoláza spadající do třídy lyáz. Rozlišujeme její dva izoenzymy – aldolázu A a B.

4. + 5. Aldolové štěpení Fru-1,6-bisP na dvě fosforylované triózy a izomerace trióz

5. Izomerace trióz

Glyceraldehyd-3-P a dihydroxyaceton-3-P se mohou přeměnit jeden v druhý pomocí enzymu triózafosfátizomerázy. Této reakci se přikládá velký význam, protože do další reakce glykolýzy se zapojuje jen glyceraldehyd-3-P a tato izomerace kontinuálně doplňuje jeho cytosolický pool.

6. Oxidace glyceraldehyd-3-P na 1,3-bisfosfoglycerát

Tato reakce je jedinou oxidační reakcí v celé glykolýze. Oxidaci katalyzuje glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza. Reakcí vzniká 1,3-bisfosfoglycerát (energeticky bohatá sloučenina) a redukovaný kofaktor – NADH+H⁺. Reakce je exergonní – na oxidací nově vzniklou skupinu COO– se naváže P_i makroergní anhydridovou vazbou.

6. Oxidace glyceraldehyd-3-P na 1,3-bisfosfoglycerát

7. Přeměna 1,3-bisfosfoglycerátu na 3-fosfoglycerát

1,3-bisfosfoglycerát je hydrolyzován na 3-fosfoglycerát pomocí fosfoglycerátkinázy. Zároveň dojde k substrátové fosforylaci (fosforylace na substrátové úrovni) – z ADP se tvoří ATP.

8. Izomerace 3-fosfoglycerátu na 2-fosfoglycerát

Izomeraci katalyzuje fosfoglycerátmutáza.

9. Dehydratace 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát (PEP)

Dehydrataci 2-fosfoglycerátu katalyzuje enzym enoláza. Reakce vede ke vzniku makroergní sloučeniny fosfoenolpyruvátu, který obsahuje esterově vázanou fosfátovou skupinu.

10. Přeměna fosfoenolpyruvátu na pyruvát

Nejdříve probíhá odštěpení P_i, poté se nestabilní enol-pyruvát izomerizuje na stabilnější keto-pyruvát. Během této přeměny se uvolňuje velké množství volné energie. Tato reakce je tedy silně exergonická a prakticky nevratná. Uvolněná energie se využije k syntéze ATP z ADP – substrátová fosforylace.

Reakci katalyzuje regulační enzym pyruvátkináza.

Během 4.–10. reakce se vytvořily dvě molekuly ATP na jeden tříuhlíkatý fragment (Pyr). Energetická bilance celé glykolýzy je tedy +2 moly ATP na 1 mol glukózy (−2 ATP spotřebováno, +4 ATP vytvořeno).

Metabolické osudy pyruvátu

Pyruvát je větvícím bodem glykolýzy. Osud pyruvátu závisí na oxidačním stavu buňky – NADH musí být reoxidováno na NAD⁺.

Za aerobních podmínek se pyruvát transportuje do matrix mitochondrie, kde se prostřednictvím pyruvátdehydrogenázové reakce mění na acetyl-CoA, který se může zapojit například do Krebsova cyklu. Redukovaný kofaktor NADH nemůže jednoduše přestoupit do matrix mitochondrie, kde by se měl zapojit do procesů v dýchacím řetězci, protože mitochondriální membrána je pro něj nepropustná. Proto se využívá k redukci některých látek – např. cytoplazmatického oxalacetátu na malát či dihydroxyaceton-P na glycerol-3-P. Vzniklé produkty již vnitřní mitochondriální membránou procházejí a dopraví tak redukční ekvivalenty do mitochondrie. Hovoříme o tzv. člunkovém mechanismu či jednoduše o čluncích. Pro přestup NADH existují v buňce dva různé člunky (anglicky shuttle) – glycerol-fosfátový a malát-aspartátový. V mitochondrii proběhnou výše uvedené reakce opačným směrem:

Malát + NAD⁺ → oxalacetát + NADH+H⁺

Glycerol-3-P + FAD → dihydroxyaceton-P + FADH₂

Získané redukované kofaktory následně mohou vstoupit do mitochondriálního dýchacího řetězce, kde jsou regenerovány – souběžně vzniká aerobní fosforylací ATP. Návrat oxalacetátu (OAA) zpět do cytosolu není přímý. Vyžaduje nejdříve transaminaci na aspartát, kterou katalyzuje aspartátaminotransferáza (AST). V cytosolu proběhne opačná reakce – vzniká OAA.

Za anaerobních podmínek (např. intenzivně pracující sval s nedostatečnou dodávkou kyslíku) či v erytrocytech se pyruvát přeměňuje na laktát, který je následně uvolněn z buňky do krevního oběhu. Zároveň dochází k regeneraci NAD⁺. Reakci katalyzuje enzym laktátdehydrogenáza (LDH):

Pyruvát + NADH + H⁺ → laktát + NAD⁺

Přeměna pyruvátu na laktát

Touto reakcí vytvořené NAD⁺ je koenzymem pro glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu, bez níž by se glykolýza zastavila. Vznikající laktát se jednak může zapojit do Coriho cyklu, jednak může být oxidován v tkáních s aerobním metabolismem (srdce, játra) na CO₂ a H₂O. Kumulace laktátu podmiňuje pokles pH, který způsobí svalovou bolest a únavu.

Na tomto místě je třeba připomenout, že aerobní glykolýza produkuje mnohem více ATP na 1 mol glukózy než anaerobní glykolýza.

2,3-BPG shunt

V erytrocytech hraje významnou roli odbočka glykolýzy nazývaná 2,3-BPG shunt. 1,3-bisfosfoglycerát se při ní přeměňuje na 2,3-bisfosfoglycerát. Tento meziprodukt již neobsahuje makroergicky vázaný fosfát, a při jeho další přeměně na 3-fosfoglycerát se tedy nesyntetizuje ATP – uvolní se jen anorganický fosfát. Erytrocyt tak při tomto průběhu glykolýzy získá méně ATP. Význam odbočky ale spočívá v tom, že 2,3-bisfosfoglycerát snižuje afinitu hemoglobinu ke kyslíku, tj. podílí se na regulaci transportu kyslíku na hemoglobinu.

Regulace glykolýzy

Regulačními body v glykolýze jsou tři enzymy:

1. 6-fosfofrukto-1-kináza;
2. pyruvátkináza;
3. hexokináza.

Tyto enzymy katalyzují nevratné exergonní reakce.

6-fosfofrukto-1-kináza (PFK-1)

Fosfofruktokináza, allosterický enzym regulovaný několika aktivátory a inhibitory, je hlavním regulačním bodem glykolýzy:

1. Zvýšení poměru ATP / AMP vede k inhibici glykolýzy

   Glykolýza je děj směřující ke tvorbě ATP.

   ATP je substrátem a současně i allosterickým inhibitorem tohoto enzymu. AMP se oproti tomu chová jako aktivátor enzymu. Při nadbytku ATP se tedy zastaví další spotřeba glukózy jako živiny.

2. Citrát inhibuje glykolýzu

   Pokud jsou oxidovány mastné kyseliny, vzniklý acetyl-CoA inhibuje PDH.

   Vznikající pyruvát směřuje do karboxylace na oxalacetát. Je-li současně dostatek acetyl-CoA i oxalacetátu, syntetizuje se citrát, který se hromadí před enzymem isocitrátdehydrogenázou. Citrát uniká do cytoplazmy, kde blokuje regulační enzym glykolýzy. Signalizuje totiž, že v mitochondrii je dostatek substrátů Krebsova cyklu, a tudíž není zapotřebí tvořit další.

3. Fruktóza-2,6-bisfosfát (Fru-2,6-P)

   Fruktóza-2,6-bisfosfát, aktivátor glykolýzy, funguje jako prodloužená ruka inzulinu – jeho koncentrace se zvyšuje, pokud je poměr inzulin / glukagon zvýšený. Vzniká z fruktóza-6-P reakcí katalyzovanou 6-fosfofruktokinázou-2 (PFK-2).

4. Glykolýzu aktivuje inzulin a inhibují ji kontraregulační hormony

   Vzestup poměru inzulin / glukagon snižuje intracelulární koncentraci cAMP; tím nastává převaha defosforylačních dějů. Pokles poměru a působení dalších kontraregulačních hormonů vyvolá naopak vzestup koncentrace cAMP – převažují fosforylační děje. 6-fosfofrukto-1-kináza je aktivní v defosforylované formě.

5. Inhibice kyselým pH

   6-fosfofrukto-1-kináza je inhibována protony. Jak pyruvát, tak laktát jsou poměrně silné kyseliny a jejich významná akumulace by mohla ohrozit buňku. Proto jejich zvýšené koncentrace vedou skrze protony k inhibici regulačního enzymu.

Zbylé enzymy mají menší význam, proto je popíšeme jen velmi stručně. Jak jsme již uvedli, hexokinázu jednak inhibuje její produkt – Glc-6-P, jednak ji aktivuje inzulin. Pyruvátkinázu reguluje kovalentní modifikace pod vlivem poměru inzulin / glukagon.

Klinické korelace

Mezi poměrně časté enzymatické defekty patří vrozený deficit pyruvátkinázy. Postiženy jsou převážně erytrocyty, v nichž se tvoří méně ATP. Z toho vyplývá jejich nižší schopnost udržet integritu své membrány (aktivní membránové transporty) a svůj tvar. Důsledkem je jejich zvýšený rozpad – rozvíjí se hemolytická anémie. Při nedostatečném okysličování tkání (hypoxii) se ve zvýšené míře tvoří laktát, který jako poměrně silná kyselina způsobuje okyselení těla – tomuto poklesu pH se říká laktátová acidóza.