Sérologické metody

Sérologické metody jsou souborem vyšetřovacích technik, které jsou založené na reakci mezi antigenem a protilátkou. Jedna složka reakce je vždy známá, druhou vyšetřujeme. Sérologie se využívá zejména v mikrobiologii k diagnostice původců onemocnění. Je většinou rychlejší než kultivace a umožňuje záchyt i špatně kultivovatelných původců (např. viry). Podle konkrétního diagnostického postupu lze sérologii řadit mezi přímé i nepřímé metody detekce patogenního agens.

Základní princip

Pro sérologii se nejčastěji využívá krevní sérum, ale je možné použít i jiné biologické materiály (sputum, moč, sliny, likvor). Existují tři hlavní principy:

1. průkaz antigenu,
2. průkaz protilátek,
3. sledování buněčné imunity.

Průkaz antigenu

Antigeny prokazujeme pomocí sady známých protilátek. Využívají se jak polyklonální protilátky, které se vážou s několika epitopy předpokládaného antigenu v našem vzorku, tak monoklonální protilátky, které umožňují přesnější určení typu patogenu. Přítomnost antigenních molekul značí přítomnost infekčního agens.

Průkaz protilátek

Protilátky prokazujeme pomocí známého antigenu. Odpovědí na přítomnost antigenních molekul je zpravidla reakce imunitního systému. Vzhledem k různé dynamice tvorby protilátek jejich průkaz nemusí znamenat akutní onemocnění. V časných fázích infekce se objevují protilátky IgM (někdy IgA), později pak třída IgG, která může přetrvávat po prodělaném onemocnění. Pro testování je nutné udělat více odběrů a vyhodnotit je v čase. Vyšetření je problematické u imunodeficitních pacientů.

Metody

Zpětná (sklíčková) aglutinace

Zpětná aglutinace pomáhá určit konkrétní antigenní složení mikroba izolovaného od pacienta pomocí známých sérových protilátek. U Escherichia coli tato reakce umožňuje odlišit jednotlivé kmeny. Identifikace sérovaru O157:H7 je klíčová u závažných variant průjmových onemocnění nebo hemolyticko-uremického syndromu.

Přímá aglutinace

Přímá aglutinace je metoda, při níž se stanovují protilátky v séru pacienta přidáním suspenze známých bakterií. Antigeny se nachází na povrchu bakterie (bičíky, liposacharidy). Vazba protilátky na O-antigen, polysacharidový řetězec liposacharidu (endotoxin), způsobí vznik kompaktní sraženiny. H-antigeny bičíků vytváří sraženinu připomínající nadýchané obláčky nebo zamlžené sklo. Přímá aglutinace se využívá při průkazu bakterií rodu Salmonella (tzv. Widalova reakce) u břišního tyfu, dále bakterií rodu Brucella (Wrightova reakce), nebo ricketsií (Weilova-Felixova reakce).

Přímá hemaglutinace

U přímé hemaglutinace jsou antigenní molekulou povrchové struktury erytrocytů. Pozitivní reakce, která se projeví aglutinací červených krvinek, je způsobena vazbou protilátek produkovaných cizorodými organismy na tyto struktury. Příkladem je Paulova-Bunnelova reakce na průkaz infekční mononukleózy.

HIT

HIT neboli inhibice hemaglutinace se používá u chřipkových virů a jiných půvoců nesoucích hemaglutinin. Protilátky navázané na virus hemaglutinaci inhibují.

Schéma HIT

Aglutinace na nosičích

Antigeny nebo protilátky jsou při této metodě umístěny na nosiči. Nosičem mohou být erytrocyty nebo latexová média. Při tzv. pasivní aglutinaci jsou antigeny (endotoxin, Vi faktor salmonel) umístěny na erytrocytech a po přidání séra se shlukují. Pasivně můžeme prokazovat též Treponemu pallidum (Dubosova-Hiddlebrokova reakce). Latexové testy využívané při diagnostice revmatoidní artritidy mají jako antigen gama-globulin. Dále se latexových nosičů využívá při přímém průkazu streptokoků, meningokoků, pneumokoků.

Precipitace

Při precipitaci vzniká nerozpustný komplex reakcí protilátky s rozpustným (koloidním) antigenem. Vhodným prostředím je vodný roztok nebo agarový či agarosový gel.

Precipitace v roztoku

• Prstencová reakce: ve zkumavce se roztok protilátek převrství roztokem antigenu. Sraženina se objeví v podobě prstence na rozhraní vrstev.
• Flokulační reakce: smísením roztoku antigenu a protilátky dochází k vysrážení komplexu v podobě vloček. Tato reakce je základem VDRL screeningu syfilitidy.

Precipitace v gelu

Do jamek vykrojených v gelu se nakapou roztoky antigenu a protilátek. Difúze roztoků skrz gel vytváří následně v zónách určité koncentrace tzv. precipitační linie. Linie vznikají v místě setkání antigenu a protilátek a jsou viditelné jako sraženiny. Příkladem této reakce je průkaz toxinu u C. diphtherieae.

Dvojité uspořádání podle Ouchterlonyho

Do agaru je vykrojena centrální jamka, kam je nakapáno sérum pacienta. V okolí je následně vykrojeno několik jamek pro antigeny. Mezi centrální jamkou a jamkami s antigeny po difuzi vznikají precipitační linie odpovídající specifitě antigenu a protilátek:

• linie plynule splývají (antigeny jsou totožné),
• linie částečně splývají, jedna z nich dále pokračuje (antigeny jsou příbuzné),
• linie se nezávisle protínají (nepříbuzné antigeny).

Možné výsledky precipitace v gelu

Komplementfixace

Komplementfixační reakce jsou založeny na vlastnostech komplementu. Volný komplement lyzuje erytrocyty a je schopen vazby na komplex antigen-protilátka (A-P). V okamžiku, kdy komplement naváže komplex A-P, nedokáže již dále erytrocyty porušovat. Ve vzorku krevního séra od pacienta musí být komplement inaktivován teplotou. Místo něj je dodáván komplement ze séra morčat. Bordetova-Wassermanova reakce je již méně používanou metodou pro diagnostiku syfilis. Antigenem je kardiolipin, který při kontaktu se sérovými protilátkami Treponema pallidum vytváří komplex. Při pozitivní reakci nevykazují erytrocyty lýzu (komplement je navázán na komplex A-P). Negativní reakce se projeví lýzou buněk (protilátky proti T. pallidum nejsou přítomné, kardiolipin nemá s čím vytvořit komplex, který by se mohl navázat na komplement). Na tomto principu dnes fungují například průkazy brucel, listeriózy, Mycoplasma pneumoniae a různých virových infekcí.

Neutralizace

Při neutralizačních reakcích jsou inhibované vlastnosti antigenů. U virových infekcí (tzv. VNT = virus neutralizační testy) se přítomnost protilátek projeví například jejich neschopností infikovat pokusné zvíře. Mezi neutralizační reakce patří tedy i výše uvedený HIT. Další využití je při průkazu antistreptolysinu O, protilátek proti streptolysinu O u streptokoků typu A, C, G (např. Streptococcus pyogenes). K séru pacienta přidáme známou koncentraci streptolysinu. Pokud jsou přítomny protilátky, jeho účinky se neutralizují a nedochází k lýze přidaných erytrocytů. Koncentrace přidávaného streptolysinu nižší než 200 m. j. je norma, koncentrace vyšší než 200 m. j. jsou po nedávno prodělané infekcí nebo při jejích následcích (např. glomerulonefritida).

Metody značených protilátek

Pří těchto metodách se využívají protilátky nebo antigeny značený různými indikátory (např. fluoescenční barviva, enzymy). Můžeme sem zahrnout:

• ELISA,
• RIA,
• Western blotting,
• imunofluorescence.

Odkazy

Související články

• Kultivace

Externí odkazy

• Imunologické metody 2. LF

Použitá literatura

• JULÁK, Jaroslav. Praktická cvičení a semináře z lékařské mikrobiologie. 2. vydání. Praha : Karolinum, 2009. 113 s. ISBN 978-80-246-1141-9.

• BEDNÁŘ, Marek, Andrej SOUČEK a Věra FRAŇKOVÁ, et al. Lékařská mikrobiologie : Bakteriologie, virologie, parazitologie. 1. vydání. Praha : Marvil, 1996. 558 s. ISBN 8023802976.

• JULÁK, Jaroslav. Úvod do lékařské bakteriologie. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2006. 404 s. ISBN 8024612704.

• GOERING, Richard V a Hazel M DOCKRELL. Mimsova lékařská mikrobiologie. 5. vydání. Praha : Triton, 2016. 568 s. ISBN 978-80-7387-928-0.