Principy terapie dědičných chorob

V současné době se zkoumají možnosti genové terapie na řadu onemocnění.

Zárodečná genová terapie

• zásah v gametě, v zygotě nebo buňkách embrya ve velmi raném stadiu vývoje
• genetická změna se nachází ve všech buňkách nově vzniklého organismu
• vliv bb, ze kterých vznikají gamety, proto je přenosná na potomky
• nemůžeme odhadnout výsledky v dalších generacích, etické bariéry před provedením zárodečné genové terapie

Somatická genová terapie

• provedení genetické změny v somatických buňkách, nebo tkáních
• tkáně jsou vybírány podle typu onemocnění
• manipulace v buňkách lze provádět ex vivo, in vivo
• Ex vivo = buňky  jsou odebrány do vhodného prostředí, po provedení terapie jsou vráceny zpět
• In vivo = vhodná pro bb, které je nemožné kultivovat nebo navrátit zpět do organismu

• vektor nesoucí gen by mohl být vpraven přímo do tkáně
• úspěšnost těchto pokusů je velmi malá
• nejvhodnější bb pro genovou terapii – dlouhá délka života, proliferují, lze je snadno získat
• příkladem jsou kmenové bb kostní dřeně – jsou ale špatně izolovatelné

Modifikace somatických buněk

Několik přístupů:

• vnesení funkční kopie genu do bb, mutantní gen zůstává nezměněn
• oprava mutantního genu nebo umístění fungující kopie genu na místo mutantního genu
• cílená inhibice exprese genu
• cílené zničení specifických buněk (významné u nádorů)
• zničení specifických buněk bb imunitního systému

Cílem je dlouhodobá exprese vneseného genu.

Cizí gen se tedy musí integrovat do chromozomu hostitelské buňky, bb musí mít schopnost dalšího dělení. Cizí gen se tedy následně přenáší do dceřiných buněk - dojde k různé integraci genu, v dalších cyklech se tedy nachází na jiných místech.

Virové vektory

• viry vyvinuly účinné systémy, jak vpravit svoje genomy do lidských bb
• virus se musí modifikovat tak, aby jeho genom nepoškodil lidskou buňku
• většina virového genomu je odstraněna, nahrazena lidským s promotorovými a regulačními oblastmi
• vysoká účinnost

Retrovirové vektory

• genom retrovirů je tvořen RNA, obsahuje 3 geny (gag, pol, env) a sekvenci fí, která je rozpoznávána virovými proteiny - zkompletování virové partikule
• mají vlastní reverzní transkriptázu
• po vstupu do hostitelské buňky vyvolá reverzní transkripci = vznik cDNA
• cDNA se napojí do hostitelské informace při dělení (jsou porušené membrány)
• klonovací kapacita je 8 kb
• vektor s lidským genem je vpraven do speciálních buněk, které vytvoří mnoho kopií retrovirů s lidskou sekvencí
• modifikované retroviry jsou pak inkubovány se somatickými buňkami pacienta (lymfocyty)
• dojde k inzerci lidského genu do DNA hostitelských buněk s vysokou účinností
• choroba : těžká kombinovana imunodeficience (SCID)

Adenovirové vektory

• dsDNA zůstane v jádře lidské buňky, ale neintegruje se do jejího genomu
• vektor musí být stejně modifikován jako retrovirus
• infikují bb, které se nedělí (dýchacího systému)
• terapie cystické fibrozy – lidský gen CFTR do adenoviru – modifikovaný virus byl aplikován epiteliálním bb dýchacích cest v podobě aerosolu
• malá účinnost, pouze přechodná exprese genu

Adeno – asociované virové vektory

• ssDNA, jejíž replikace je závislá na přítomnosti viru
• nevyvolávají žádnou imunitní reakci
• jako adenoviry mohou infikovat nedělící se bb
• pojmou malý inzert – 5kb
• vektor pro geny pro faktor IX lidem s hemofilíí B

Lentivirové vektory

• komplexní retroviry, mohou infikovat i nedělící se bb
• do jádra vstupují otvory v jaderném obalu
• klonovací sekvence cca 8kb
• antivirus = např. HIV

Problémy spojené s virovou genovou terapií

• přechodná exprese, nízká exprese genu
• obtížné získání specifických bb, tkání (neurony)
• potřeba přesné regulace aktivity genu
• potenciální nebezpečí nádorové transformace buňky (náhodná inzerce viru do buňky může ovlivnit expresi vedlejšího genu, což může být protoonkogen)
• imunitní reakce organismu proti virovému vektoru

Vektory nevirové povahy

• přímá injekce DNA do tkáně
• nastřelení kovových částic, které obsahují DNA
• spojení DNA s molekulou, která je navázána prostřednictvím receptorů na povrch buňky, následuje endocytóza
• velmi malá účinnost při těchto metodách

Lipozomy

• uměle vytvořené částice tvořené fosfolipidovou dvojvrstvou, které mohou pojmout poměrně velký inzert DNA
• mohou fúzovat s buňkou, a tak přenést DNA inzert do cytoplazmy
• neobsahují peptidy = nevyvolávají imunitní odpověď

Blokáda exprese genu

• produkty genu fungují v komplexech molekul (dimery)
• mutovaný protein  v komplexu může ovlivnit jejich funkci
• inhibicí transkripce nedojde k expresi genu
• náhrada poškození genu homologní rekombinací

onemocnění	cílové buňky	produkt inzertu
SCID	lymfocyty, stem cells kostní dřeně	adenosindeaminaza
hemofile B	hepatocyty	faktor IX
cystická fibroza	epitel. Bb dýchacích cest	CFTR
familiární hypercholesterolemie	hepatocyty	LDL receptor
Duchenova muskulární dystrofie	myoblasty	dystrofin
AIDS	TH lymfocyty	retrovirová mutace

_____________

1. Genová léčba
   • př. transformace klonovanými geny
     • choroba: deficience adenosindeaminasy (těžká kombinovaná imunodeficience)
2. Indukce enzymu
   • př. barbituráty
     • choroba: kongenitální nehemolytická žloutenka (viz diferenciální diagnostika ikteru)
3. Náhrada enzymu
   • př. transplantace tkáně
     • choroba: mukopolysacharidózy
   • př. substituce enzymu
     • choroba: deficience trypsinu
4. Substituce proteinu
   • př. antihemofilní globulin
     • choroba: hemofilie
5. Substituce vitaminu
   • př. vitamin D
     • choroba: vitamin D rezistentní rachitis
6. Substituce produktu
   • př. kortison
     • choroba: adrenogenitální syndrom
   • př. tyroxin
     • choroba: kongenitální hypothyreosa
7. Omezení substrátu v dietě
   • př. AMK – Phenylalanin
     • choroba: fenylketonurie (viz Poruchy metabolismu aromatických a větvených aminokyselin)
   • př. cukry – galaktosa
     • choroba: galaktosemie
   • př. tuky – cholesterol
     • choroba: hypercholesterolemie (viz Dědičné poruchy metabolizmu tuků)
8. Léky snižující nadbytečný produkt defektního metabolismu
   • př. cholestyramin
     • choroba: hypercholesterolemie (v éře statinů obsoletní)
   • př. penicilamin
     • choroba: M. Wilson
9. Náhrada orgánu
   • př. transplantace ledvin
     • choroba: polycystická choroba ledvin
10. Odstranění orgánu
    • př. kolektomie
      • choroba: familiární polypóza tlustého střeva

Odkazy

Související články

• Genové manipulace a genové inženýrství
• Léčba onemocnění způsobených poruchami metabolismu aminokyselin a sacharidů
• Léčba metabolických onemocnění z poruch beta-oxidace mastných kyselin a peroxizomálních onemocnění

Zdroj

• ŠTEFÁNEK, Jiří. Medicína, nemoci, studium na 1. LF UK [online]. [cit. 2009]. <http://www.stefajir.cz>.