Denaturace nukleových kyselin, molekulární hybridizace

Denaturace nukleových kyselin

Vodíkové můstky ve dvouřetězcové DNA (double strand DNA, dsDNA), lze zrušit extrémním pH, močovinou nebo teplem. Následné oddělení řetězců, tj. denaturaci DNA, je možné sledovat pomocí tzv. hyperchromního efektu. Vlivem interakce elektronů v párovaných bazích roztoky dsDNA absorbují UV světlo (při 260 nm) méně, než stejná koncentrace bazí v mononukleotidech nebo v jednořetězcové DNA (single strand DNA, ssDNA). Zahřívá–li se roztok dsDNA, pak při určité teplotě absorbance náhle stoupne. Teplota, při které je první derivace křivky nejvyšší, se nazývá bod tání DNA (melting point, T_m). Čím více párů G≡C zkoumaná dsDNA obsahuje, tím vyšší je T_m. Tři vodíkové můstky v G≡C vyžadují více tepelné energie než dva v A=T.

Denaturace DNA je reverzibilní. Komplementární ssDNA se např. při poklesu teploty nebo snížení koncentrace močoviny mohou opět spojit v dsDNA. Rozplétání a splétání dvoušroubovice je in vivo běžným jevem (např. při biosyntéze nukleových kyselin). Spojování dvou komplementárních řetězců nukleových kyselin in vitro do dvoušroubovic se nazývá reasociace. Pokud reasociují různé typy nukleových kyselin (DNA s RNA), jde o molekulární hybridizaci. Metodicky se těchto jevů využívá k oddělení určité ssDNA nebo ssRNA ze směsi, k mapování genomu a ke zjištění poruch struktury genu (diagnostika genetických vad).

Technické uspořádání reasociace nukleových kyselin je různé. Nejdříve se např. na membránový filtr nebo na sacharidový gel v koloně naváže ssDNA o známé sekvenci, komplementární k nukleové kyselině hledané ve směsi. Při průtoku zkoumané směsi nukleových kyselin takto upraveným filtrem či kolonou se hledaná komplementární ssDNA nebo ssRNA asociuje s DNA fixovanou k nosiči. Po promytí lze zachycenou nukleovou kyselinu uvolnit (eluovat) vhodným činidlem rušícím vodíkové můstky.

Pro diagnostické účely se DNA pacienta (z lymfocytů, amniových buněk apod.) v definovaných místech nejdříve rozštěpí některou z restrikčních endonukleáz. Směs fragmentů se rozdělí gelovou elektroforézou. Pak se zjistí, zda–li některý z fragmentů DNA obsahuje určitou sekvenci nukleotidů, kritickou pro danou nemoc. Postupuje se tak, že fragmenty DNA se z gelového elektroforeogramu přenesou na materiál vhodnější k hybridizaci, tj. nitrocelulózový filtr. Tento filtr je třeba položit na suchý filtrační papír, na filtr přitisknout elektroforeogram a na tento gel přiložit filtrační papír navlhčený v koncentrovaném roztoku soli.

Uspořádání blottingu

Elektroforetické frakce (fragmenty DNA) se „přepijákují“ (blotting) na nitrocelulózový filtr a denaturují se. Tím se vytvoří vhodné technické podmínky pro reasociaci komplementárních řetězců. Filtr se přelije roztokem radioaktivně značené a krátké umělé nukleové kyseliny, která obsahuje hledanou sekvenci. Tato tzv. próba se asociuje pouze s restrikčním fragmentem DNA obsahujícím komplementární sekvenci, což po opláchnutí filtru ukáže přiložená fotografická fólie (autoradiografie).

Popsanou metodu analýzy restrikčních fragmentů DNA vypracoval Eduard M. Southern. Nese jeho jméno (Southern blotting) a je velmi rozšířena. Jestliže se zcela analogickým způsobem hledá komplemetární sekvence ve směsi blotovaných mRNA, mluví se o tzv. Northern blottingu. Jméno pana Southerna (česky pana Jižního) se stalo obětí nomenklaturního vtipu (northern = severní). Imunochemici v této legraci pokračovali: při western blottingu (western = západní) se jedná o analogickou techniku, kde však interaguje antigen s protilátkou. V každém případě blotting představuje elegantní, rychlou a rutinně zvládnutelnou metodu.