Polymorfismy nukleových kyselin

Polymorfismus je existence dvou či více variant (alel, sekvenčních variant, proteinů apod.), které jsou zastoupeny v populaci s frekvencí ≥ 0.01^[1]. Obvykle je považujeme za nepatogenní sekvenční varianty. Samotný polymorfismus nebo jejich kombinace se může podílet na vzniku onemocnění. Polymorfní části bývají především v nekódujících sekvencích DNA a to z důvodu, že nepodléhají selekci. Nejčastější formou polymorfismu bývá záměna basí.

Jednonukleotidové polymorfismy (SNP)[upravit | editovat zdroj]

SNP v DNA

Většina SNP (Single Nucleotide Polymorphism) se nachází v nekódujících oblastech DNA. Nejčastěji k nim dochází substitucí jednoho nukleotidu. Také může docházet k inzerci či deleci. Polymorfismy v jednom nukleotidu se často využívají jako markery (při studiu náchylnosti k onemocněním nebo citlivosti k léčbě farmaky atd.).

Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů (RFLP)[upravit | editovat zdroj]

SNP polymorfismy mohou zapříčinit změnu restrikčního místa (ztráta, nový vznik). Důsledkem je změna délky restrikčního fragmentu, v takovém případě hovoříme o polymorfismu v délce restrikčních fragmentů (RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism).

Tento polymorfismus lze odhalit kombinací metod PCR nebo Southernovou hybridizací (pokud je známa sekvence DNA v oblasti polymorfního místa) s restrikčním štěpením pomocí specifické restriktázy. Sledované úseky lze vizualizovat hybridizací se značenými sondami DNA, které jsou úplně nebo alespoň z části komplementární k restrikčním fragmentům DNA.

Elektroforéza restrikčních fragmentů

Na obrázku vidíme dva homologní chromozomy A a B, přičemž u chromozomu B došlo ke vzniku nového restrikčního místa. To způsobilo, že z původního fragmentu velkého 5 kb vznikly dva fragmenty o velikosti 2 kb a 3 kb. Vpravo máme obraz na gelové elektroforéze, která nám prokázala přítomnost dvou fragmentů, odlišně dlouhých od ostatních fragmentů.

Podrobnější informace naleznete na stránce Polymorfismus délky restrikčních fragmentů.

Polymorfismus v počtu tandemových repetic (VNTR)[upravit | editovat zdroj]

VNTR (Variable Number of Tandem Repeats polymorphism) mohou být zdrojem delečního, případně inzerčního polymorfismu. Důsledkem těchto změn je odlišný počet kopií tandemových repetitivních jednotek v rámci homologních chromozomů. Zahrnuje také mikrosatelitové (STR – Short Tandem Repeats) a minisatelitové sekvence.

Detekce VNTR (minisatelity)[upravit | editovat zdroj]

Detekci mikrosatelitových i minisatelitových sekvencí lze zjistit využitím kteréhokoliv restrikčního enzymu, který štěpí DNA na obou koncích tandemové repetice. Oblasti VNTR bývá obtížné amplifikovat standardní PCR, používáme spíše Southernovu hybridizaci.

Po štěpení vybraným restrikčním enzymem lze využít dvou typů sond. Sonda 1 hybridizuje s úsekem DNA mimo oblast repetic (autoradiogram – jeden pruh, pokud je oblast repetic na obou DNA stejně dlouhá, dva pruhy při rozdílné délce). Sonda 2 hybridizuje přímo s tandemovými repetetivními sekvencemi. Tyto sekvence se mohou vyskytovat i na jiných místech genomu, sonda tak detekuje mnoho různě dlouhých lokusů současně.

Tento typ analýzy se nazývá DNA fingerprinting. Využíval se k identifikaci jedinců a stanovení příbuznosti (forenzní medicína, paternitní spory). V dnešní době se multilokusové sondy využívají jako mikrosatelitové markery. Použitím alespoň 15 vysoce polymorfních markerů (které nejsou ve vazbě) jsme schopni vytvořit DNA profil jedince.

Mikrosatelity (STR)[upravit | editovat zdroj]

Často používané mikrosatelitní sekvence bývají dinukleotidové repetice (nejčastěji CA – cytosin, adenin). Počet jejich repetic je vysoce variabilní v daném místě DNA různých chromozomů. Základní repetitivní jednotka má kolem 2–4 bp^[2], pomocí PCR pak amplifikujeme obvykle úsek obsahující celou repetitivní oblast. Vzápětí separujeme tyto sekvence pomocí gelové elektroforézy.

Mechanismy vzniku mikrosatelitních polymorfismů[upravit | editovat zdroj]

Nejpravděpodobnějším mechanismem vzniku variability mikrosatelitů je polymorfismus vzniklý nepřesným párováním komplementárních vláken DNA obsahujících repetitivní sekvenci, vzniklé sklouzáváním DNA-polymerázy a řetězce DNA. Nazývá se replikační sklouznutí. Způsobuje jak inzerce, tak delece jedné nebo několika repetic v nově syntetizovaném řetězci.

Polymorfismus vzniklý inzercí nebo delecí velkých tandemových repetic bývá nejčastěji způsoben nerovnoměrným crossing overem nebo nerovnoměrnou výměnou sesterských chromatid.

Mezi alelními i nealelními sekvencemi může nastat nereciproký přenos sekvence tzv. genová konverze. Ta způsobuje, že jeden pár interagujících sekvencí zůstává nezměněn (donor), zatímco pár druhý se změní (akceptor). Část sekvence akceptoru je nahrazena kopírovanou sekvencí donora.

Odkazy[upravit | editovat zdroj]

Související články[upravit | editovat zdroj]

Zdroje[upravit | editovat zdroj]

ŠTEFÁNEK, Jiří. Medicína, nemoci, studium na 1. LF UK [online]. [cit. 2010]. <https://www.stefajir.cz/>.

ŠÍPEK, Antonín. Genetika [online]. [cit. 2010]. <http://www.genetika-biologie.cz/>.

Použitá literatura[upravit | editovat zdroj]

KOHOUTOVÁ, Milada. Lékařská biologie a genetika (II. díl). 1. vydání. Praha : Nakladatelství Karolinum, 2013. 202 s. ISBN 978-80-246-1873-9.

↑ KOHOUTOVÁ, Milada. Lékařská biologie a genetika (II. díl). 1. vydání. Praha : Nakladatelství Karolinum, 2013. 202 s. ISBN 978-80-246-1873-9.
↑ KOHOUTOVÁ, Milada. Lékařská biologie a genetika (II. díl). 1. vydání. Praha : Nakladatelství Karolinum, 2013. 202 s. ISBN 978-80-246-1873-9.

[1] KOHOUTOVÁ, Milada. Lékařská biologie a genetika (II. díl). 1. vydání. Praha : Nakladatelství Karolinum, 2013. 202 s. ISBN 978-80-246-1873-9.

[2] KOHOUTOVÁ, Milada. Lékařská biologie a genetika (II. díl). 1. vydání. Praha : Nakladatelství Karolinum, 2013. 202 s. ISBN 978-80-246-1873-9.

[1]

[2]