Mikroskopické metody

Mikroskopie je souhrn aplikací optiky, které se využívají k zobrazení struktur, které nejsou viditelné pouhým okem. Oko (biofyzika) rozliší strukturu jednotlivých bodů (detailů), které jsou od sebe vzdáleny 0,2 mm a k tomu, aby bylo schopné rozlišit i menší struktury, je nutné je zvětšit pozorovací úhel. Různé způsoby mikroskopického zobrazování se rozlišují na základě druhu záření přicházejícího do objektu (světlo, ultrafialové záření, polarizované světlo, infračervené záření apod.), nebo podle způsobu uspořádání optické soustavy (procházející světlo, odražené světlo, emitované fluorescencí, apod.). Tam, kde nestačí rozlišovací schopnost světelné mikroskopie (rozliší 200 nm), se používá mikroskopie elektronová nebo mikroskopie atomárních sil, které rozliší detaily na úrovni 0,1 nm.

Optická mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

Optická mikroskopie umožňuje pozorovat věci, které již naše oko nedokáže rozlišit (rozlišovací schopnost, tedy schopnost rozeznat 2 u sebe ležící body, je u člověka 0,25mm). Rozlišovací schopnost světelné mikroskopie je přibližně 0,25 µm, což je dáno vlnovou délkou záření, které mikroskopem prochází (v tomto případě světlo, proud fotonů), ale také vlastnostmi objektivu (viz dále). Rozlišovací schopnost světelné mikroskopie je tedy 1000 krát větší, než rozlišovací schopnost lidského oka. Maximální užitečné zvětšení, kterého lze ve světelné mikroskopii dosáhnout, je až 2000 u speciálních mikroskopů. Pro vyšší úroveň detailu se využívá elektronová mikroskopie nebo mikroskopie atomárních sil.

Optical microscope nikon alphaphot

Světelný mikroskop se skládá ze tří spojných optických soustav: osvětlovací soustava (kondenzor), objektiv a okulár. Dále má část mechanickou, která mikroskop dotváří.

Osvětlovací soustava (na obrázku pod číslem 7) slouží k osvětlení preparátu, nejčastěji proti směru pozorování. Preparát, který je tímto způsobem prosvětlován, tak musí být částečně průhledný.

Objektiv (na obrázku pod číslem 3) je soustava čoček s velmi krátkou ohniskovou vzdáleností, které dohromady fungují jako spojná čočka a zobrazují tak předmět (preparát) převrácený, skutečný a zvětšený. Výsledný obraz se promítá mezi ohnisko okuláru a okulár.

Okuláry (na obrázku pod číslem 1) jsou také tvořeny soustavou čoček, které fungují jako čočka spojná. V tomto případě plní funkci lupy, která vytváří obraz zdánlivý, přímý a zvětšený obraz.

Podrobnější informace o světlené mikroskopii najdete zde: Světelná mikroskopie.

Zobrazovací metody ve světelné mikroskopii[upravit | editovat zdroj]

Metoda světelného pole[upravit | editovat zdroj]

Metoda procházejícího světla

Metoda světlého pole je úvodní metodou optické mikroskopie. Světlo prochází pozorovaným objektem (v procházejícím světle) a soustava dvou spojných čoček vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz, který pozorujeme přes okulár. Při této metodě má objekt tmavé obrysy a nachází se ve světlém poli na rozdíl od tmavého pole, kde objekt je světlý a nachází se naopak v tmavém poli.

Metoda tmavého pole[upravit | editovat zdroj]

Metoda tmavého pole

Princip této metody spočívá v tom, že předmět je osvětlený pomocí kondenzoru tak, že do roviny objektu vstupují jen okrajové, velmi šikmé světelné paprsky, dokud středové nejsou pohlcené, a proto se vůbec při zobrazování neuplatňují. Objekt je teda osvětlený ze stran a paprsky se od něho odrážejí a lámou. Do objektivu sa tedy dostane světlo, které je rozptýlené předmětem. Předmět se jeví jako svítící na tmavém pozadí, a proto je velmi dobře viditelný. Tudíž při pozorování v temném poli je prázdné zorné pole tmavé a až světlo, které se rozptýlí při dopadu na preparát a následně prochází částečně objektivem, vytváří obraz.

Při pozorování v tmavém poli září na tmavém podkladě ty části objektu, na kterých dochází k dostatečnému rozdílu při průchodu světla pozorovaným objektem, jako například na jeho hranách.

Pro suché objekty s numerickou aperturou do 0,65 nejsou potřeba speciální kondenzory, provádí se zastínění výstupní čočky kondenzoru clonou pro tmavé pole, která je ve volitelné výbavě mikroskopu. Zdroj musí mít dostatečný výkon, neboť se přo tomto pozorování používá jen zlomek světelné intenzity zdroje. Při použití objektivů vysokých číselných apertur, hlavně imerzních objektivů, se pro tmavé pole používají imerzní kardioidní kondenzory. Tyto kondenzory mají numerickou aperturu 1,05 a jejich přední čočka se spojuje se spodní stranou preparátu imerzním olejem. Číselná apertura objektivu musí být vždy menší než apertura kondenzoru, jinak by došlo k osvětlení ve světlém poli.

Metoda se používá pro pozorování drobných objektů a jejich povrchových struktur, např. prvoků, bakterií, rostlinných pletiv, pylových zrn atd.

Metoda fázového kontrastu[upravit | editovat zdroj]

Metoda fázového kontrastu

Tento způsob mikroskopování, který objevil v roce 1932 (a v 1953 obdržel Nobelovu cenu) holandský fyzik Frits Zernike, umožňuje zřetelné vstoupení i nejmenších struktur, které jsou v běžném světle skoro neviditelné.

Metoda slouží k zvýraznění kontrastu malých fázových objektů, u kterých se detaily od okolí absorpcí neliší, ale způsobují změnu fáze. Metoda převádí rozdíly v posunu fáze světla procházejícího různými částmi objektu, které nevidíme, na rozdíly intenzit, které pozorovat můžeme.

Přesnější princip fungování spočívá ve vložení speciální destičky s kruhovou štěrbinou na kondenzor, na které vzniká ohybové spektrum. Nebarevné objekty, které se liší od okolí indexem lomu a tloušťkou, způsobují změnu fáze procházejícího světelného vlnění, kterou ale lidské oko nezaregistruje. Speciální destička zabezpečí posun fáze světla přímého obrazu světelného zdroje o ¼ vlnové délky oproti fázi světla ohybových obrazů. Při interferenci vln v obrazové rovině se části objektu, které různým způsobem mění fáze světla, projeví různou intenzitou světla. Dostaneme tak kontrastní obraz fázového předmětu.

Výhodou této metody je, že nepoškozuje živé biologické objekty a umožňuje jejich pozorování v čase. To je například důležité při studiu buněčných a tkáňových kultur. Fázová mikroskopie nám rovněž umožňuje pozorovat celý průběh mitózy.

Ultrafialová mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

BW EM spectrum

Ultrafialová mikroskopie využívá jako světelný zdroj UV záření, které se vyznačuje kratší vlnovou délkou než má viditelné světlo v rozsahu přibližně 400 - 10 nm, což zvyšuje rozlišovací schopnost mikroskopu. Pro člověka je UV záření neviditelné (ačkoliv některá zvířata jej dokáží vnímat) a proto je nutné záznam výsledného obrazu provádět fotograficky nebo pomocí speciální snímací CCD kamery. Protože běžné sklo UV záření nepropouští, je nahrazeno optikou z křemenného skla (případně z jiných vyhovujících materiálů). Až na tyto výjimky je základní uspořádání (předmět, objektiv, okulár) zachováno jako u optických mikroskopů.

Infračervená mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

Základní charakteristika je ve využití infračerveného záření pro zobrazení předmětu. Infračervené záření, jehož vlnová délka se pohybuje v intervalu 760 nm - 1 mm (v IRM se používá hlavně vlnových délek v rozsahu 760-1100 nm, tzv. blízká oblast), je neviditelné a má výrazné tepelné účinky (lidské tělo je vnímá jako sálavé teplo). Některými objekty proniká snadněji než viditelné světlo a proto ho lze využít i pro studium silnějších preparátů. Využití IRM je i v možnosti analýzy složitých směsí, kdy složky směsi mají různé absorpční vlastnosti v infračervené oblasti.

Inverted Microscope

Základní uspořádání (předmět, objektiv, okulár) zůstává zachováno jako u optických mikroskopů, avšak pro zaznamenávání je vzhledem k charakteru záření nutné používat speciální fotomateriály citlivé na infračervené záření. Další odlišností je využití sférických zrcadel místo klasických čoček, protože infračervené záření je pohlcováno sklem a po průchodu sklem se neláme jako viditelné záření.

Inverzní mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

Inverzní mikroskopie využívá obvykle viditelného záření a řeší potřebu pozorování objektů, nesevřených do stísněného prostoru mezi podložním a krycím sklíčkem. Umožňuje pozorování objektů v tlustostěnných nádobách (např. Petriho miskách), případně objektů volně plovoucích v kapalinách v různých miskách. Z využití viditelného záření také vyplývá omezená možnost zvětšení.

Konstrukčně se uvedených předností dosahuje tím, že se zdroj světla nachází nad mikroskopovým stolkem, předmět je uložen v misce na stolku, objektiv je uložen pod stolkem a okulárová část bývá zařazena za hranolový nebo planární odražeč (zrcadlo) do směru příhodného pro pohodlné pozorování.

Více o inverzním mikroskopu najdete zde: Inverzní mikroskop

Polarizační mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

Cholesterol Crystals Synovial Fluid Polarized Light

Polarizační mikroskopie využívá optické aktivity zkoumaného preparátu (tj. schopnost preparátu stáčet rovinu polarizovaného světla). Polarizační mikroskop je tedy kombinací polarimetru a mikroskopu. Konstrukčně je PM zcela shodný se standardním optickým mikroskopem, avšak do optické dráhy světla jsou zařazeny dva polarizační filtry, které mají zkřížené polarizační roviny. Paprsky zdroje světla procházejí nejprve tzv. polarizátorem (dříve krystal dvojlomné látky, nyní plastový polarizační filtr) - zde dochází ke vzniku polarizovaného světla, dále procházejí pozorovaným objektem, normálním objektivem, dále druhým polarizačním filtrem tzv. analyzátorem a následně okulárem. Jestliže má pozorovaný objekt, ležící mezi polarizátorem a analyzátorem, polarizační vlastnosti, dojde po průchodu světla preparátem ke stočení polarizační roviny a vznikne obraz v černém poli a barevný obraz předmětu. Ten vzniká tím, že preparát způsobil porušení podmínky zkřížení rovin a jeví se jako barevný.

Více o polarizační mikroskopii najdete zde: Polarizační mikroskopie

Interferenční mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

Interferenční mikroskopie pracuje na principu porovnávání paprsku po průchodu vzduchem a druhého po průchodu vzorkem. Tato metoda se využívá při zkoumání průhledných struktur, které nechceme z nějakých důvodů barvit. Dále slouží k vizualizaci různých povrchů a membrán.

Dvousvazkový interferenční mikroskop se skládá z optického mikroskopu a interferometru. Pomocí soustavy interferometru,, kondenzoru a Wollastonova hranolu je paprsek přicházející k preparátu rozdělen na dva. Jeden prochází skrz vzorek, který změní jeho fázi. Druhý prochází mimo a slouží proto jako referenční. Tato metoda pracuje na principu temného pole - při vhodném nastavení interferometru je přicházející paprsek složen ze dvou, které jsou vůči sobě posunuty o půl vlnové délky, takže v případě neumístění vzorku se paprsky "vyruší" a v zorném poli neuvidíme nic. Když však jeden paprsek bude procházet preparátem a jeho vlnová délka se změní, změní se i celková vlnová délka výsledného paprsku a v interferometru, potažmo v okuláru už nebude "temno" ale obraz zkoumaného vzorku.

Existují ještě vícesvazkové mikroskopy, které porovnávají více paprsků a mikroskopy využívající interferenčního fázového kontrastu, který umožňuje zvýraznění určité buněčné struktury.

Více o interferenční mikroskopii najdete zde: Interferenční mikroskopie

Fluorescenční mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

Fluorescence je proces kdy nějaká látka po absorpci kvanta záření emituje záření o delší vlnové délce. Můžeme mluvit o fluorescenci primární, to když látka v preparátu sama funguje jako fluorochrom (např. chlorofyl), a o sekundární, kdy je ke vzorku přidán fluorochrom, který označí původně nefluorescenční struktury (např. imunoglobuliny s fluorescenčním markerem v imunohistochemii).

Samotný jev je závislý na elektronovém obalu jednotlivých atomů. Když elektron v obalu absorbuje foton, zvýší se jeho energie a excitovaný elektron "přeskočí" do orbitalu s vyšší energií. Postupně ale energii ztrácí v podobě fotonu s nižší energií a delší vlnovou délkou a elektron padá do původního orbitalu. Fotony s nižší energií se emitují v podobě světla, které pozorujeme v mikroskopu.

Fluorescenční mikroskop je optický mikroskop se silným zdrojem záření (většinou rtuťové, nebo xenonové výbojky), monochromátorem (propustí jen jednu vlnovou délku - barvu světla) a kondenzorem.

Tento mikroskop se používá např. k detekci jednotlivých proteinů, či molekul v buňce.

Laserová konfokální skenovací mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

Konfokální mikroskopie umožňuje sledovat objekty s vysokou rozlišovací schopností a bez rušivých vlivů právě nezaostřených rovin preparátu.

Je toho docíleno tak, že světlo vyzářené laserem směrem k preparátu prochází nejdříve úzkou štěrbinou - bodovou clonkou, která paprsek koncentruje do jednoho bodu ve vzorku. Odtud paprsky prochází do objektivu, kde je umístěna druhá clonka,která eliminuje paprsky, které nepocházejí z onoho bodu ve vzorku. Paprsky, které projdou jsou detekovány na fotonásobiči a informace o poloze a podobě jsou odeslány do počítače.

Takto se analyzuje tolik bodů, aby byl pokryt celý vzorek a počítač mohl vytvořit výslednou podobu.

Více o konfokálním mikroskopu najdete zde: Konfokální mikroskop

Elektronová mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

Více o elektronové mikroskopii najdete zde: Elektronová mikroskopie

Díky mikroskopii jsme schopni pozorovat věci, které jsou nad rámec rozlišitelnosti našeho oka, a tedy jsou pro nás běžným okem neviditelné. Mikroskopie využívá metody uhlového zvětšení. Zvětšujeme při tom zorný úhel, který svírají paprsky vycházející z okrajových bodů předmětu a procházejí optickým středem oční čočky. Úhlové zvětšení optických přístrojů charakterizuje následující vzorec:

            γ = τ´/τ

Kde τ´je zvětšený zorný úhel při pozorování optickým přístrojem a τ je zorný uhel při pozorovaní okem. Jestliže se bavíme o mikroskopii, uhlové zvětšení mikroskopu je:

            γ = Δd /f₁ x f₂

kde f1 je obrazová ohnisková vzdálenost objektivu, f2 je předmětová ohnisková vzdálenost okuláru, Δ je optický interval mikroskopu a d je konvenční zraková vzdálenost. Podle typu dopadajícího záření na objektiv rozlišujeme různé typy mikroskopie, např. světelná, polarizační, fluorescenční a elektronová.

Elektronová mikroskopie

Elektronová mikroskopie pracuje na podobném principu jako mikroskopie světelná, která využívá princip lupy ke zvětšení zorného úhlu. V případě světelného mikroskopu okulár funguje jako lupa, kterou se pozorovatel dívá na obraz vytvořený objektivem. Jak okulár tak objektiv představují soustavu dvou spojných čoček. U elektronové mikroskopie je to podobně, ale na rozdíl od světelné, která využívá proud fotonů a spojné skleněné čočky¨, v elektronové mikroskopii je proud fotonů nahrazený proudem elektronů a k nasměrování paprsků přes vzorek na obrazovku se používají elektromagnetické čočky (magnety). Pod elektromagnetickou čočkou si můžeme představit v podstatě cívku, která vytváří vhodně tvarované magnetické pole, které ovlivňuje dráhu elektronů. Zvětšení a rozlišovací schopnost jsou v elektronovém mikroskopu značně lepší a to hlavně díky mezní rozlišovací schopnosti. Ta je přímo úměrná vlnové délce dopadajícího záření. Protože elektrony mají kratší vlnovou délku než světlo, jejich rozlišovací schopnost je mnohokrát větší a dosahuje až 0,05 nm. Zvětšení ve špičkových mikroskopech může dosahovat až 10 000 000 x.

Mezi základní dva typy elektronových mikroskopů patří, mikroskop transmisní a mikroskop rastrovací. U transmisního elektronového mikroskopu částečky procházejí přímo přes vzorek a až potom jsou zachycené. Při tomto typu mikroskopie musí být urychlování napětí dostatečně velké, aby elektrony měly dostatečnou energii penetrovat přes vzorek a rovněž vzorek musí být velmi tenký, 10-500 nm. Zatímco transmisní mikroskop využívá metodu procházejících elektronů, rastrovací metodu elektronů odražených. U rastrovacího elektronového mikroskopu jsou částečky nasměrované na přechod přes vzorek pod určitým uhlem a následně se odrážejí, čímž se vytváří 3D obraz.

Elektronová mikroskopie se využívá v mnohých oblastech jako např. v materiálovém výzkumu nebo v biologických aplikacích. Je schopná poskytnout komplexní informace o mikrostruktuře, chemickém složení a dalších vlastnostech zkoumaného vzorku.

Mikroskopie atomárních sil (AFM) ze skupiny metod sondové mikroskopie[upravit | editovat zdroj]

Podstatou mikroskopu je sonda z křemíkového nitridu umístěná na pružině ze stejného materiálu. Na pružinu míří laser a jeho paprsek se odráží do fotodetektoru. Velikost sondy je v řádu jednotlivých nanometrů.

V bezkontaktním režimu Sonda přejíždí nad povrchem zkoumané látky a vlivem kapilárních a Van der Waalsových sil (v řádech nanonewtonů) se ohýbá pružina. Paprsek z laseru mění úhel dopadu i odrazu a na fotodetektor dopadá v jiném místě.

V dalším, kontaktním režimu se pružina ohýbá v souladu s povrchem, jak se sonda dotýká hlubších a vyšších míst.

Informace o místech dopadu na detektor počítač použije pro modelaci zkoumaného povrchu. Modifikace AFM umožnějí také vizualizaci magnetických domén, nebo detekci jednotlivých molekul na základě specifického chování sondy.

Výhodou této metody je až miliardové zvětšení, které dovoluje zobrazovat jednotlivé molekuly, výsledný 3D obraz a možnost měřit v různých prostředích (vakuum,

kapalina, vzduch...) bez speciálních úprav vzorku. Nevýhodou je velmi vysoká pořizovací cena a nízká rychlost.

Více o mikroskopii skenovací sondou najdete zde: Mikroskopie skenovací sondou