Elektroforéza bílkovin v séru

Jedním ze základních screeningových vyšetření je elektroforéza sérových bílkovin.

Princip elektroforézy sérových bílkovin

 Podrobnější informace naleznete na stránce Elektroforéza.

Elektroforéza (ELFO) je založena na pohybu nabitých částic v elektrickém poli. Stanovované látky musí mít charakter iontů nebo amfolytů. Bílkoviny patří mezi amfolyty, které mohou nabývat kladného i záporného náboje v závislosti na pH pufru, při kterém elektroforéza probíhá. Je-li směs nabitých částic vystavena působení elektrického pole, začnou se molekuly látek pohybovat. Pohyblivost bílkovin je ovlivněna těmito faktory:

• charakterem dělené látky (velikost náboje, tvar a velikost molekul, relativní molekulová hmotnost);
• vlastnostmi prostředí, ve kterém dělení probíhá (hodnota pH, iontová síla, napětí, proud).

Pozitivně nabité molekuly proteinů se lépe adsorbují než negativně nabité molekuly, a proto při elektroforéze proteinů jsou využívány negativní náboje. Izoelektrický bod většiny sérových bílkovin je v oblasti slabě kyselé při pH 5–6. Proto v prostředí alkalického pufru, nejčastěji pH 8,6, budou u sérových bílkovin převažovat záporné náboje a jejich pohyb bude s různou rychlostí směřovat k anodě. Albumin vykazuje nejvyšší negativní náboj a tím i nejrychlejší pohyblivost k anodě.

Elektroforéza může probíhat na různých nosičích. Historicky nejstarším byl chromatografický papír. V klinicko-biochemické praxi se nejčastěji setkáváme s elektroforézou na acetátcelulózových foliích nebo na agarózovém gelu. Při elektroforéze, která využívá jako nosič papír nebo acetátcelulózu, putují molekuly bílkovin roztokem pufru, který je vně nosiče. Molekuly se tedy dělí především podle svého náboje. Podobně se budou dělit bílkoviny i v málo koncentrovaném agarózovém gelu.

Pomocí elektroforézy se bílkoviny krevního séra rozdělí obvykle na 5–6 frakcí – albuminovou, α₁, α₂, β, γ frakce se někdy rozliší na β₁ a β₂. S výjimkou albuminů jsou další frakce tvořeny vždy skupinou bílkovin, které mají přibližně stejnou elektroforetickou pohyblivost.

Provedení

Kapka séra je přidána na sklíčko s elektroforetickým agorózovým gelem a rozprostřena po „startovní čáře“, kolmo na směr budoucího elektrického pole. Poté je vystavena účinkům elektrického pole v elektroforetické vaně. Vlivem elektrického pole začínají proteiny migrovat v agarózovém gelu.

Po uplynutí určité doby (např. 30 minut při napětí 120 V) se bílkoviny v gelu denaturují („fixují“), zpravidla působením alkoholů (metanolu) a kyselin (kyseliny octové). Tím se zabrání jejich difuzi nebo vymytí z gelu v dalších krocích. Poté se bílkoviny obarví vhodným organickým barvivem (např. amidočerní). Poloha jednotlivých frakcí a koncentrace bílkovin v nich se poté hodnotí pomocí denzitometrie.

Více informací o elektroforéze formou on-line videa najdete např. na stránkách Masarykovy Univerzity.

Hodnocení elektroforézy sérových bílkovin

Elektroforéza plazmatických bílkovin a denzitometrický záznam

Rerenční hodnoty jednotlivých elektroforetických frakcí

Název frakce	Hodnoty v relativních %	Hodnoty v g/l
Albumin	55–69	35–44
α1	1,5–4	1–3
α2	8–13	5–8
β	7–15	4–10
γ	9–18	5–12

Charakteristika jednotlivých frakcí

Zóna prealbuminu

V této oblasti se pohybuje prealbumin (transtyretin), jehož zóna je však velmi diskrétní a těžko hodnotitelná.

Zóna albuminu

Albumin vytváří poměrně širokou a z obou stran dobře ohraničenou zónu. Při poklesu koncentrace albuminu pod 30 g/l je patrné její oslabení. Vzácně pozorované zdvojení frakce je projevem genetické strukturní odchylky albuminu u heterozygotů – bisalbuminemie nebo vzniká při navázání cizorodé substance na albumin, např. penicilinu.

Interzóna mezi albuminem a α₁-globuliny

Slabé homogenní zbarvení této oblasti je podmíněno α₁-lipoproteiny. Podobnou elektroforetickou pohyblivost vykazuje také α₁-kyselý glykoprotein, ale zabarvení zóny ovlivňuje minimálně.

Zóna α₁-globulinů

Zónu α₁-globulinů ovlivňuje především α₁-antitrypsin. Při akutních zánětech je zřetelné zesílení. Klinicky významná je genetická variabilita α1-antitrypsinu, která se v elektroforéze může často zřetelně projevit oslabením, někdy až vymizením jeho zóny se současnou změnou pohyblivosti.

Interzóna mezi α₁ a α₂-globuliny

Obvykle je celá slabě homogenně zbarvená.

Zóna α₂-globulinů

Na vytváření této zóny se podílejí především dvě bílkoviny – α₂-makroglobulin a haptoglobin. Změny koncentrace α₂-makroglobulinu nemají velký diagnostický význam. Haptoglobin vytváří 6 fenotypů, které se liší elektroforetickou pohyblivostí. Elektroforetické vyšetření neumožňuje rozlišení fenotypů haptoglobinu.

Interzóna mezi α₂ a β₁-globuliny

Normálně se barví pouze slabě. Při hemolýze vznikají komplexy hemoglobin-haptoglobin, které v této oblasti vytvářejí samostatnou zónu.

Zóna β₁-globulinů

Tvar a intenzita zbarvení zóny β₁-globulinů je ovlivněna prakticky pouze transferinem. Intenzita zóny dobře koreluje s celkovou vazebnou kapacitou plazmy pro železo. Při anemii z nedostatku železa a v těhotenství se zvyšuje syntéza transferinu a intenzita zóny se zesílí. Další protein s β₁-elektroforetickou pohyblivostí, hemopexin, se špatně barví používanými barvivy a změny v jeho koncentraci se v elektroforéze neprojeví.

Interzóna mezi β₁  a β₂-globuliny

V této oblasti nalézáme imunoglobulin IgA, který podmiňuje homogenní zbarvení zóny. Dále zde vytváří typickou linii β-lipoprotein, jejíž přítomnost závisí na jeho koncentraci.

Zóna β₂-globulinů

Na vytváření zóny β₂-globulinů se podílí C3 složka komplementu. Podle intenzity zbarvení se dá těžko odhadnout koncentrace C3.

Zóna γ-globulinů

Charakter zóny γ-globulinů je ovlivněn koncentracemi čtyř podtříd imunoglobulinu IgG. Zvýšení IgG se projeví intenzivnějším zbarvením a rozšířením zóny v obou směrech. Imunoglobulin IgM leží blíže startu. Samostatné nebo současné zvýšení koncentrace IgM pomocí elektroforézy nerozpoznáme.

Klinické využití

Elektroforéza sérových bílkovin (ELFO) se provádí zejména, zjistíme-li patologický výsledek celkové bílkoviny, nebo potřebujeme-li podrobnější informaci o sérových bílkovinách. Zvlášť cenné je pro průkaz:

• dysproteinemie – změna koncentrace a kvalitativního složení jednotlivých bílkovin v séru,
• paraproteinemie – charakterizována přítomností monoklonálních imunoglobulinů.

ELFO u některých patologických stavů

Typ elektroforeogramu	Komentář	Alb	α1	α2	β	γ	Výskyt (příklad)
Akutní zánět	zvýšení pozitivních reaktantů akutní fáze (α1-antitrypsinu, orosomukoidu, haptoglobinu, ceruloplazminu, CRP, C3) pokles negativních reaktantů akutní fáze						akutní fáze infekčních onemocnění akutní poškození tkáně (infarkt myokardu, chirurgický výkon) větší popáleniny
		↓ nebo N	↑	↑		N
Chronický zánět	polyklonální zmnožení imunoglobulinů						rekonvalescence po infekčním onemocnění některá revmatická onemocnění
		↓ nebo N	N	N	N	↑
Chronický aktivní zánět	zvýšení α-globulinů svědčí o reaktivaci procesu						chronická aktivní revmatoidní artritida
		↓	↑	↑	N	↑
Hepatální typ	vázne proteosyntéza v hepatocytech nadměrná tvorba imunoglobulinů někdy se neoddělí β a γ frakce (tzv. β-γ můstek – při zvýšení IgA)						chronická jaterní onemocnění – jaterní fibróza a cirhóza
		↓	↓	↓	↓	↑
Nefrotický typ	výrazné ztráty bílkovin močí (převládají renální ztráty albuminu) zvýšení bílkovin s největší Mr – α2-makroglobulinu a β-lipoproteinu						nefrotický syndrom
		↓	N	↑	↑	↓ nebo N
Hypogamaglobulinemie	pokles v oblasti γ globulinů						primární deficity tvorby protilátek sekundární deficit tvorby protilátek ztráty imunoglobulinů
		N	N	N	N	↓
Monoklonální gamapatie	homogenní vrchol kdekoliv v oblasti β až γ1						benigní monoklonální gamapatie maligní monoklonální gamapatie (myelom)
		↓	↓	↓	↑	↑

Odkazy

Související články

• Plazmatické bílkoviny
• Elektroforéza
• Dysproteinemie

Externí odkazy

Video o elektroforetických metodách používaných v klinické biochemii pro vyšetření bílkovin v séru a moči