Vyšetření moči/chemické

			Článek byl označen za rozpracovaný, od jeho poslední editace však již uplynulo více než 30 dní
			Chcete-li jej upravit, pokuste se nejprve vyhledat autora v historii a kontaktovat jej. Podívejte se také do diskuse.
			Pokud vše nasvědčuje tomu, že původní autor nebude v editacích v nejbližší době pokračovat, odstraňte šablonu {{Pracuje se}} a stránku upravte.
			Stránka byla naposledy aktualizována v úterý 20. října 2009 v 17:56.

Běžně se v moči kvalitativně zjišťuje bílkovina, glukóza, hemoglobin, ketolátky a žlučová barviva. Tyto součásti se většinou vyskytují i v moči zdravých osob, ale v tak malém množství, že je běžnými zkouškami neprokážeme. Za různých patologických stavů se jejich koncentrace v moči zvyšuje.

Zkumavkové reakce

Dříve se k průkazu patologických součástí moči používaly barevné a srážecí reakce prováděné tzv. „mokrou cestou“ (ve zkumavkách). Souhrnně jsou jejich principy v tabulce:

Principy stanovení patologických součástí močí pomocí barevných a srážecích reakcí prováděných ve zkumavkách

Analyt	Princip reakce	Jednotlivé zkoušky
Bílkovina	denaturace bílkovin	zkouška s kyselinou sulfosalicylovou Hellerova zkouška (s koncentrovanou HNO3) zkouška varem
Hemoglobin	pseudoperoxidázová aktivita hemového železa – katalyzuje oxidaci vhodných chromogenů na barevné produkty peroxidem vodíku	Heitz-Boyerova zkouška (oxidace redukovaného fenolftaleinu) zkouška benzidinová (oxidace o-tolidinu nebo tetrametylbenzidinu)
Glukóza	nespecifické zkoušky založené na redukčních vlastnostech glukózy	Fehlingova zkouška (redukce Cu2+) Benedictova zkouška (redukce Cu2+) Nylanderova zkouška (redukce Bi3+)
Ketolátky	reakce s nitroprusidem sodným v alkalickém prostředí za vzniku fialového komplexu	Legalova zkouška Lestradetova zkouška
Bilirubin	oxidace bilirubinu na zelený biliverdin nebo modrý bilicyanin	Rosinova zkouška (s jódem) Gmelinova zkouška (s koncentrovanou HNO3)
Urobilinogen	reakce urobilinogenu s 4-dimethylaminobenzaldehydem v kyselém prostředí za vzniku barevného kondenzačního produktu	Ehrlichova zkouška

Testovací (diagnostické) proužky

Průkaz patologických součástí moči přímo u lůžka nemocného nebo v linii prvního kontaktu s pacientem umožňuje vyšetřování pomocí testovacích proužků.

Testovací proužky jsou tvořeny nosičem z umělé hmoty, na němž jsou upevněny jedna nebo více indikačních zón. Ty jsou vyráběny tak, že do vhodného materiálu (např. speciální filtrační papír) se nasaje kapalné analytické činidlo, které se šetrně vysuší.

Diagnostické proužky se dodávají jako monofunkční, polyfunkční nebo proužky pro speciální vyšetření.

Monofunkční proužky obsahují základní indikační zóny pro semikvantitativní stanovení určité látky v moči. Polyfunkční proužky jsou tvořeny několika indikačními zónami, umožňujícími vyšetření několika biochemických parametrů najednou. Jsou určeny pro případy, kdy je zapotřebí získat co nejvíce informací o zdravotním stavu pacienta, např. při různých screeningových akcích. Kromě monofunkčních a polyfunkčních proužků existují proužky pro speciální vyšetření, kde jsou zařazeny kombinace dvou nebo více indikačních zón, které jsou zvoleny pro vyšetření určitého onemocnění, např. proužky pro screening diabetes mellitus obsahují zónu pro stanovení glukosy, ketolátek, bílkoviny a pH.

Pomocí testovacích proužků lze stanovit tyto parametry v moči:

• bílkovina
• glukóza
• ketolátky
• bilirubin
• urobilinogen
• hemoglobin, erytrocyty
• kyselina askorbová
• leukocyty
• dusitany
• pH
• specifická hmotnost

Principy stanovení jednotlivých parametrů

Bílkovina

3´,3´´,5´,5´´-tetrachlorfenol-3,4,5,6-tetrabromsulfoftalein; v alkalickém prostředí nebo po navázání bílkoviny označená hydroxylová skupina disociuje a barva sloučeniny se změní ze světle žluté na tmavě zelenomodrou

Princip stanovení bílkovin v moči pomocí diagnostických proužků je založen na tzv. bílkovinné chybě acidobazického indikátoru, např. tetrabromfenolové modři, etylesteru tetrabromfenolftaleinu či 3´,3´´,5´,5´´-tetrachlorfenol-3,4,5,6-tetrabromsulfoftaleinu. Jako každý acidobazický indikátor tyto látky při určitém pH mění svou barvu (chovají se jako slabé kyseliny, přičemž protonovaná forma má jiné zbarvení než disociovaná forma): při pH nižším než 3,5 jsou žluté, při vyšším pH jsou zelené až modré. V reakční zóně testovacího proužku je kromě indikátoru i pufr, který udržuje pH v rozmezí 3,0 až 3,5, indikátor tedy má žlutou barvu. Jsou-li ve vzorku bílkoviny, naváží se svými aminoskupinami na indikátor. Tím ovšem změní jeho vlastnosti – přechodová oblast se posune směrem ke kyselejšímu pH. Znamená to, že při uvedeném konstatním pH mezi 3,0 až 3,5 bude mít indikátor s navázanou bílkovinou zelenou barvu, jako kdyby byl v alkaličtějším prostředí (proto bílkovinná chyba indikátoru). Intenzita zbarvení závisí na koncentraci bílkoviny, kolísá od zelené až po modrou a hodnotí se vizuálně nebo instrumentálně.

U výrazně alkalických močí (pH nad 8) nebo je-li moč velmi koncentrovaná, může test dávat falešně pozitivní výsledky (dojde k vyčerpání pufru v reakční zóně). V těchto případech moč okyselíme několika kapkami zředěné kyseliny octové na pH 5–6 a test opakujeme. Falešnou pozitivitu mohou také způsobit vysoké koncentrace některých látek s aminoskupinami (kontaminace odběrové nádoby některými dezinfekčními prostředky), jež se na indikátory váží podobně jako bílkoviny.

Nevýhodou testovacích proužků je jejich rozdílná citlivost vůči jednotlivým bílkovinám. Proužky reagují velmi dobře s albuminem a jeho přítomnost indikují v moči od 0,1 až 0,5 g/l. Podstatně nižší citlivost vykazují vůči globulinům, glykoproteinům a Bence-Jonesově bílkovině. Těmito diagnostickými proužky nelze prokázat zvýšení albuminurie na hodnoty do asi 200 mg/l, resp. denní ztráty albuminu v rozmezí 30 až 300 mg/24 hodin, které provází zejména časnější fáze některých nefropatií. Pro skrínink zvýšení albuminurie je možno použít imunochemických metod, např. speciálních diagnostických proužků založených na imunochromatografickém principu nebo imunoturbidimetrie.

Hemoglobin

Hemoglobin katalyzuje, podobně jako peroxidáza, oxidaci (dehydrogenaci) některých substrátů (např. derivátů benzidinu) peroxidem vodíku:

$\mathrm {H} _{2}\mathrm {O} _{2}+\mathrm {H} _{2}\mathrm {A} \ {\xrightarrow[{\mathrm {nebo\ hemoglobin\ a\ jin{\acute {e}}\ l{\acute {a}}tky} }]{\mathrm {peroxid{\acute {a}}zy} }}\ 2\ \mathrm {H} _{2}\mathrm {O} +\mathrm {A}$

Nejedná se však o enzymovou aktivitu (katalýzu podmiňuje hemové železo), a proto se neztrácí ani po tepelné denaturaci. Hovoříme o pseudoperoxidázové aktivitě, která se využívá k citlivým, ale nespecifickým důkazům hemoglobinu nebo stopových množství krve. Výhodné je ke sledování reakce použít chromogenní substrát, tj. látku poskytující dehydrogenací výrazně zbarvený produkt (často benzidin nebo jeho nekancerogenní deriváty, aminofenazon apod.).

Reagenční zóna diagnostických proužků obsahuje chromogen (např. tetrametylbenzidin) se stabilizovaným peroxidem vodíku (např. kumenhydroperoxidem). V přítomnosti volného hemoglobinu (hemoglobinurie) se indikační zóna zbarví rovnoměrně modře. Pokud jsou v moči přítomny erytrocyty (erytrocyturie), vytvářejí se intenzivně zelenomodře zbarvené tečky až skvrny.

S hemoglobinurií se můžeme setkat u intravaskulární hemolýzy. K častější erytrocyturii vede jak poškození glomerulární membrány (glomerulární hematurie), tak krvácení z jakékoliv části vývodných cest močových. Často ji nacházíme u infekcí močových cest, urolitiázy a nádorů urogenitálního traktu.

Kromě hemoglobinu poskytuje pseudoperoxidázovou reakci i myoglobin, který se může do moči vylučovat při rozpadu kosterního svalstva (rabdomyolýza, crush-syndrom). Pozitivita zkoušky může být způsobena i peroxidázami leukocytů či některých bakterií, kvasinek nebo plísní, které se mohou vyskytovat v moči zejména při infekcích močových cest. Chceme-li vyloučit možnost falešně pozitivní reakce účinkem buněčných peroxidáz, je nutno reakci provádět s povařenou močí.

Kontaminace odběrové nádoby silnými oxidačními činidly rovněž vyvolává falešnou pozitivitu reakce. Na druhé straně může přítomnost silně redukujících látek (např. kyselina askorbová) zpomalit až zastavit pseudoperoxidázovou reakci a být tak příčinou falešně negativních výsledků.

Glukóza

Glukózaoxidázová a peroxidázová reakce

Diagnostické proužky pro průkaz glukózy v moči jsou založeny na principu enzymových reakcí s glukózaoxidázou a peroxidázou (stejný princip jako stanovení glykémie). D-glukóza je pomocí glukózaoxidázy oxidována kyslíkem a vzniká D-glukono-1,5-lakton a peroxid vodíku. V následné peroxidázové reakci peroxid vodíku oxiduje tetrametylbenzidin či jiný chromogen na barevný produkt. Světle žluté zbarvení reakční plošky se při pozitivitě mění na modrozelené. Test je specifický pro D-glukózu, jiné cukry neposkytují pozitivní reakci.

Vysoké koncentrace redukujících látek jako je kyselina askorbová zpomalují vývin zbarvení a mohou vést k falešně nižším výsledkům. V těchto případech se doporučuje opakovat analýzu minimálně 10 hodin po vysazení vitaminu C. Naopak falešně pozitivní výsledky mohou být způsobeny přítomností peroxidu vodíku či oxidačních činidel (některé dezinfekční prostředky) v odběrové nádobě. Stanovení glukózy v moči je nutno provést rychle, aby se zamezilo kontaminaci bakteriemi, nebo moč uchovávat při 4 °C.

Interference s kyselinou askorbovou je častým zdrojem falešných negativit. Diagnostické proužky pro vyšetření moči od některých výrobců jsou proto upraveny tak, aby reakční zóna byla vůči kyselině askorbové alespoň do určité míry odolná. Některé diagnostické proužky také mají detekční zónu pro askorbát, která na možnost falešné negativity upozorní.

Ketolátky

Stanovení ketolátek v moči

Bilirubin

Průkaz bilirubinu v moči pomocí diagnostických proužků je založen na azokopulační reakci, kterou poskytuje konjugovaný bilirubin se stabilní diazoniovou solí (např. 2,6-dichlorbenzendiazoniumtetrafluoroborát). Vzniká růžové až růžovočervené barvivo. Při současném výskytu vysokých koncentrací urobilinogenu se zbarvení mění do oranžova. V tomto případě se doporučuje vyhodnotit zbarvení až po 2 minutách od namočení indikační zóny. Nižší až falešně negativní výsledky mohou být způsobeny vysokými koncentracemi kyseliny askorbové. Vzorky moči je nutno chránit před přímým slunečním světlem, které vyvolává oxidaci bilirubinu s následným falešně nižším až negativním nálezem.

V moči se vyšetřuje pouze konjugovaný bilirubin, neboť nekonjugovaný bilirubin se do ní nemůže vyloučit.

Urobilinogen

Pro stanovení urobilinogenu v moči se podobně jako u bilirubinu využívá princip azokopulační reakce se stabilní diazoniovou solí (např. 4-metoxybenzendiazoniumtetrafluoroborát). Indikační zóna se barví v přítomnosti urobilinogenu růžově až červeně. Slabě růžové zbarvení odpovídá ještě fyziologickému vylučování urobilinogenu. V přítomnosti bilirubinu je zbarvení žluté, které přechází po 1 minutě do zeleného až modrého odstínu.

Falešnou pozitivitu mohou způsobit některé heterocyklické dusíkaté látky produkované bakteriemi při infekcích močových cest. Falešnou negativitu mohou způsobovat vysoké koncentrace askorbátu.

Leukocyty

Chemické stanovení leukocytů diagnostickým proužkem je založeno na průkazu esteráz, které jsou hojné v granulocytech. Granulocytární esterázy katalyzují hydrolýzu esteru indoxylu na volný indoxyl. Indoxyl pak reaguje se stabilní diazoniovou solí na příslušné azobarvivo. Při negativní reakci je zóna zbarvena krémově žlutě, při pozitivní reakci se mění do růžového až fialového odstínu.

Vyšetření leukocytů chemickou cestou nenahrazuje mikroskopické vyšetření. Na druhé straně je možné tímto způsobem prokázat i lyzované leukocyty (např. v hypotonické moči), což mikroskopické vyšetření neumožňuje.

Leukocyturie je příznakem zánětu ledvin nebo močových cest. Příčinou většiny pozitivních nálezů bývá bakteriální infekce močových cest. Při pozitivním nálezu leukocytů se doporučuje doplnit vyšetření proteinurie, hematurie, nitriturie, vyšetření močového sedimentu a dále mikrobiologické vyšetření.

Dusitany

Dusitany se v moči stanovují jako nepřímá známka bakteriurie. Normální moč je v měřitelných koncentracích neobsahuje. Některé především gramnegativní bakterie, jako je Escherichia coli, Proteus, Klebsiella, stafylokoky a další, mají schopnost redukovat dusičnany přítomné v moči na dusitany. Diagnostické proužky na nepřímý průkaz bakteriurie využívají dusitanů v tzv. Griessově reakci. Její podstatou je diazotace sulfanilamidu dusitany ve vzorku za vzniku diazoniové soli. Následuje azokopulace vzniklé soli s kopulačním činidlem za vývinu růžového až fialového zbarvení.

Vyšetření moči na dusitany je zapotřebí provádět v první ranní moči, neboť v tomto případě je zaručena dostatečně dlouhá doba nezbytná pro bakteriální redukci dusičnanů na dusitany v močovém měchýři. Dalším doporučením je konzumace dostatku zeleniny (obsahuje dusičnany) den před vyšetřením. Pozitivní průkaz dusitanů v moči potvrzuje bakteriurii, zatímco negativní ji nevylučuje.

Nepřímý průkaz bakteriurie je orientační a nenahrazuje mikrobiologické vyšetření.

Kyselina askorbová

Kyselina askorbová se v moči objevuje při vysokém příjmu potravou. Jako silné redukční činidlo může ovlivnit stanovení některých analytů v moči, zejména těch, které při reakcích využívají peroxid vodíku. Ten je kyselinou askorbovou přímo redukován. Rovněž rychle rozkládá diazoniové sole používané k azokopulačním reakcím.

Princip detekce kyseliny askorbové využívá kyselinu fosfomolybdenovou, která je kyselinou askorbovou redukována na molybdenovou modř. Reakce není specifická pouze pro kyselinu askorbovou, podobně reagují i jiné látky se silnými redukčními účinky.

Chemické kvalitativní vyšetření moči

• orientační stanovení pH - papírkem, pH metrem přesnější - u tubulárních acidóz
• orientační vyšetření hustoty - proužek reaguje s ionty v moči, jejich koncentrace koreluje s hustotou, falešně vyšší výsledky v močích s vyšším obsahem bílkovin

Literatura

SCHNEIDERKA, Petr, et al. Kapitoly z klinické biochemie. 2. vydání. Praha : Karolinum, 2004. ISBN 80-246-0678-X.