Zpracování periferní krve

Základní postup zpracování periferní krve

Pro dobrý výsledek cytogenetického vyšetření je nutno zachovat tento postup:

1. Odběr krve. Periferní krev odebíráme do heparinizované stříkačky (heparin je účinný antikoagulant – tzn. látka snižující srážlivost krve) v množství asi 3 ml. Jako dezinfekční prostředek, kterým očistíme místo vpichu, použijeme alkohol. Ostatní látky jsou pro buňky toxické a jejich použití by znemožnilo provést vyšetření.
2. Kultivace. Krev dále kultivujeme tři dny v médiu s obsahem fytohemaglutininu. Tato silně imunogenní látka aglutinuje krevní buňky a stimuluje lymfocyty k dělení.
3. Použití kolcemidu. Zhruba dvě hodiny před ukončením kultivace je nutno přidat do kultury kolcemid. Kolcemid je vřeténkový jed, který poruší dělicí vřeténko a zastaví tak probíhající dělení v metafázi mitózy.
4. Hypotonizace. Následně suspenzi buněk slijeme do zkumavky, centrifugujeme a slijeme supernatant. Přidáváme hypotonický roztok chloridu draselného. Voda nám postupně začíná prostupovat do nitra buňky, buňka zvětšuje svůj objem a buněčná membrána se postupně ztenčuje. Chromozomy se od sebe vzájemně rozestupují v důsledku velkého objemu buňky.
5. Fixace. Buňky fixujeme směsí methanol – kyselina octová (3:1). Třikrát tento postup opakujeme.
6. Příprava chromozomových preparátů. Suspenzi kápneme na vlhké, čisté a vychlazené podložní sklo. Suspenzi nakapeme z dostatečné výšky, aby došlo k rozrušení buněčné membrány a k uvolnění chromozomů. Po adhezi jsou chromozomy schopny barvení.

Lymfocyty periferní krve jsou nejčastěji využívaným materiálem, pokud provádíme postnatální vyšetření. Dalším možným materiálem jsou fibroblasty.

Odkazy

Použitá literatura

• KOČÁREK, Eduard a Martin PÁNEK. Klinická cytogenetika I :  Úvod do klinické cytogenetiky. 2. vydání. Praha : Karolinum, 2010. 134 s. ISBN 978-80-246-1880-7.