Uživatelka:Monika.nesc/Pískoviště

Alkalická fosfatáza (ALP) a její stanovení

Alkalická fosfatáza je metaloproteinový enzym katalyzující hydrolýzu monoesterů kyseliny fosforečné v alkalickém prostředí (v optimu pH 9,5 - 10,5) na kyselinu fosforečnou a alkohol. Ovlivňuje metabolismus makroenergických fosfátových vazeb a napomáhá transportu anorganických fosfátů přes buněčnou membránu.

Referenční rozmezí:

sérum:
děti (<14 let): 1,2 - 6,3 μkat/l
ženy: 0,7 - 2,1 μkat/l
muži: 0,9 - 2,2 μkat/l

Výskyt ALP

Alkalická fosfatáza se vyskytuje výhladně v cytoplazmatických membránách - v epitelu vývodových cest žlučových, játrech, kostech, střevech, placentě, srdci a v plicích.

Klinický význam zvýšených hodnot

• intra- i extrahepatální cholestáza
  
• reparační procesy kostí (díky zvýšené činnosti osteoblastů)
  
• zlomeniny
  
• metastázy v kostech
  
• Pagetova choroba
  
• osteomalácie
  
• virové hepatitidy (při malém zvýšení oproti hodnotám AST a ALT)
  
• nádorová onemocnění jater (při velkém zvýšení oproti hodnotám ASt a ALT)
  
• bakteriální infekce
  
• střevní onemocnění
  
• selhání ledvin
  
• biliární cirhóza
  
• hyperparatyreóza
  
• růst kostí u dětí (dle aktivity osteoblastů)
  

Klinický význam snížených hodnot (vzácné)

• intoxikace vitaminem D
  
• léčba antiepeleptiky nebo hypolipemiky
  
• hereditární hypofostatemie
  
  

Izoenzymy ALP

Alkalická fosfatáza tvoří více než 17 izoenzymů, klinicky nejdůležitější jsou 4 z nich:

• 3 tkáňově specifické izoenzymy: střevní, placentární a placentárnímu-podobný - Reganův placentární izoenzym, který vzniká při specifickém nádorovém bujení, od placentární je těžko rozeznatelný
  
• 1 tkáňově nespecifický, který zahrnuje 3 izoformy: jaterní, kostní a ledvinovou
  

U dětí převažuje izoenzym kostní (až 85% z celkové ALP), u těhotných žen zase převládá izoenzym placentární (až 50% z celkové ALP).

Stanovení

Stanovení celkové ALP

Vyšetření se prování z nehemolytického séra nebo plazmy. Materiál se odebírá do skleněných nebo plastových zkumavek s obsahem antikoagulačního činidla (Li-heparin). Materiál musí být zpracován do 4 hodin od odběru. Vyšetření se nesmí provádět z hemolytického séra, protože z erytrocytů by se uvolnily fosfomonoesterázy, to by způsobilo falešně pozitivní výsledek. Stanovení vadí také opětovné zamrazení a ohřátí vzorku. Při stanovení se nesmí vzorek setkat s EDTA, oxaláty a citráty, které tvoří cheláty, které inhibují aktivitu ALP tím, že vyváží zinečnatý kationt z jejího aktivního centra.

• Standardizovaná metoda:
  

Meření aktivity ALP se provádí při 37^oC v TRIS pufru (tris-hydroxymethyl-aminomethan) s aktivátorem při pH 10,4. Principem reakce je katalýza štěpení 4-nitrofenylfosfátu na 4-nitrofenol a fosforečnan, kdy sledujeme nárůst absorbance na spektrofotometru při 405 nm, která je přímo úměrná přibytku množství 4-nitrofenolu a tudíž přímo úměrná aktivitě ALP.

Stanovení izoenzymů ALP

Stanovení se provádí z nehemolytického séra. Materiál se odebírá nalačno. Ihned po odběru se vzorek musí transportovat do laboratoře, kde je až do zpracování (maximálně jeden týden) uložen v chladničce.

• ELFO
  

Zde se využívá rozdělení jednotlivých izoenzymů na základě různých pohyblivostí.

anoda ← (nejrychlejší) jaterní > placentární > kostní > střevní (nejpomalejší) → katoda

poté se provede denzitometrická kvantifikace.

Normální hodnoty izoenzymů:

• kostní - 60-70 %
  
• jaterní - 30-50 %
  
• střevní < 20 %
  

• Inaktivace teplem
  

Směs se na 10 minut zahřeje na 56^oC, tím dojde k úplné inaktivaci kostního izoenzymu. Ve směsy zůstane izoenzym jaterní, který se při teplotě nad 56^oC rozpadá, zato placentární izoenzym je velice termostabilní, vydrží teploty až k 65^oC. Tímto způsobem můžeme při různých teplotách změřit aktivitu různých izoenzymů.

• Inhibiční metody
  

Zde je využíváno různých inhibičních roztoků, např:
Použitím α-fenylalaninu je možné inhibovat zcela izoenzym střevní a polovinu izoenzymu placentárního.
Močovina zase inhibuje zcela izoenzym kostní, z 30 % izoenzym střevní a placentární a z 50 % izoenzym jaterní.
Pomocí homoargininu se zase inaktivují izoenzymy kostní a jaterní.

Zdroje:

• Ústav klinické biochemie a patobiochemie Univerzita Karlova, 2.lékařská fakulta a Fakultní nemocnice v Motole: Laboratorní příručka, verze: VLP_8ÚKBP_1/2009_1, Praha: 2010. ISBN 978-80-7262-660-1
  
• RACEK, Jaroslav a kol.:Klinická biochemie. 1.vydání. Praha: Galén, 1999. ISBN 80-7262-023-1