Uživatel:Tpmirchi/Biochemie
Postup
Většinu stanovujeme tak, že analyt + něco nám dá barevný komplex, jehož absorbanci stanovujeme. Koncentraci analytu získáme de facto trojčlenkou – koncentrace standardu (znáte)/absorbance standardu (změříte) = koncentrace analytu (neznáte)/absorbance standardu (změříte)
Nezapomeňte, že absorbance se vždy měří proti něčemu – blanku aka slepému vzorku :)
Stanovení koncentrace hemoglobinu v krvi
- Oxidace hemoglobinu na methemoglobin:
- HbFeII + [FeIII(CN)6]3- → HbFeIII + [FeII(CN)6]4-
- Přeměna methemoglobinu na kyanmethemoglobin:
- HbFeIII + CN- → HbFeIIICN
Oxidace dvojmocného železa v hemoglobinu hexakyanoželezitanem draselným na trojmocné železo. Vzniklý methemoglobin se s kyanidem draselným přemění na stálý kyanmethemoglobin s jediným širokým absorpčním maximem ve viditelné oblasti při 540 nm. Stanovení fotometricky.
Hodnocení
Referenční rozmezí pro dospělého muže je 130–180 g/l a pro ženu 120–160 g/l.
↑ Dehydratace
↓ Anemie
Stanovení koncentrace celkové bílkoviny v séru.
Stanovujeme biuretovou reakcí. V alkalickém prostředí v přítomnosti měďnatých solí vytváří bílkoviny komplexní sloučeniny Cu2+ s ionty peptidových vazeb - fialové zbarvení → fotometrické stanovení v oblasti 540–560 nm.
Hodnocení
Referenční rozmezí: Koncentrace celkové bílkoviny v séru (S-celková bílkovina): 65–85 g/l
↑ Dehydratace
↓ Selhání jater
Stanovení koncentrace celkového bilirubinu v séru.
Azokopulační reakce s diazoniovou solí, nejčastěji diazotovanou kyselinou sulfanilovou.
- Ta vzniká van den Berghovou diazoreakcí - reakcí kyseliny sulfanilové s dusitanem sodným v HCl
- část bilirubinu, tzv. nepřímý, je nekovalentně navázán na albumin, k jeho uvolnění se přidává do reakce akcelerátor (alkoholy, benzoan sodný, kofein...)
- Přímý (ten co nepotřebuje akcelerátor) i nepřímý bilirubin reaguje s diazoniovými solemi za vzniku intenzivně zbarvených azosloučenin, které stanovujeme fotometricky.
Hodnocení
Koncentrace celkového bilirubinu v séru (fS - celkový bilirubin): do 17 μmol/l
↑ ikterus - prehepatální, hepatální nebo posthepatální
Stanovení koncentrace triacylglycerolů v séru.
Několik po sobě jdoucích enzymových reakcí:
- Lipoproteinová lipáza katalyzuje hydrolýzu triacylglycerolů na glycerol a mastné kyseliny.
- Uvolněný glycerol se převádí působením glycerolkinázy v přítomnosti ATP na glycerol-3-fosfát, který je pomocí glycerol-3-fosfátoxidázy oxidován na dihydroxyacetonfosfát.
- Současně vzniklý peroxid vodíku je využíván v další reakci katalyzované peroxidázou k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu. Vzniká chinoniminové barvivo, jehož absorbance se odečítá.
Hodnocení
Koncentrace triacylglycerolů v séru (fS-triacylglyceroly): 0,45–1,7 mmol/l
↑ Životní styl
↓ Nebývá - malnutrice?
Stanovení koncentrace celkového cholesterolu v séru.
Několik enzymových reakcí:
- vlastnímu stanovení celkového cholesterolu předchází hydrolýza esterů cholesterolu na volný cholesterol a mastné kyseliny pomocí enzymu cholesterolesterázy (CE).
- Následuje oxidace neesterifikovaného cholesterolu na 4-cholesten-3-on za současného vzniku peroxidu vodíku v reakci katalyzované cholesteroloxidázou (CHOD).
- Poslední reakce využívá peroxidu vodíku k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu a fenolu v přítomnosti dalšího enzymu peroxidázy (POD). Vzniká barevný produkt, jehož absorbance je úměrná množství cholesterolu
Hodnocení
Koncentrace celkového cholesterolu v séru (S-cholesterol celkový): 2,9–5,0 mmol/l
↑ Životní styl, diabetici, hypothyreoza - vysoký představuje riziko kardiovaskulárních onemocnění
↓ Malnutrice, hyperthyreóza
Stanovení koncentrace močoviny v séru.
- Při nepřímém stanovení je močovina nejprve působením enzymu ureasy katalyticky rozštěpena na oxid uhličitý a amoniak, který ve vodném prostředí přechází na amonný ion.
- Doporučená rutinní metoda využívá pro stanovení amonných iontů vzniklých v ureasové reakci přeměnu α-ketoglutarátu na glutamát. Reakce je katalyzována glutamátdehydrogensou, která je spřažena s oxidací NADH na NAD+ (Warburgův optický test).
Schéma reakce zde:
Reakce katalyzovaná ureázou: Močovina + H2O + 2 H+ —→ 2 NH4+ + CO2
Reakce katalyzovaná glutamátdehydrogenázou: 2 NH4+ + 2-oxoglutarát + NADH + H+ —→ L-glutamát + NAD+ + H2O
Hodnocení
Sérová koncentrace (S-urea): 1,7–8,3 mmol/l
↑ hypoperfuze ledvin
↓ nízký příjem bílkovin
Stanovení koncentrace kyseliny močové v séru.
- Nepřímé stanovení: enzym urikasa, který přeměňuje kyselinu močovou na allantoin, peroxid vodíku a oxid uhličitý.
- Vzniklý peroxid vstupuje do spřažené reakce, katalyzované peroxidasou, při ní oxidační kopulací 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu vznikne chinoniminové barvivo, jehož intenzita zbarvení je úměrná koncentraci kyseliny močové ve vzorku.
(Při stanovení ruší kyselina askorbová. Proto je askorbátoxidasa v reakční směsi.)
Hodnocení
Koncentrace kyseliny močové v séru (fS-kyselina močová): ženy 120–340 μmol/l, muži 120–420 μmol/l
↑ vyšší příjem purinů ve stravě (maso, vnitřnosti, luštěniny), alkoholici, nižší odpad ledvinami
↓ nízký příjem purinů v potravě
Stanovení koncentrace glukózy v séru enzymaticky.
- enzym glukózaoxidáza katalyzuje oxidaci glukózy vzdušným kyslíkem za vzniku kyseliny glukonové, která přechází ve vnitřní ester glukonolakton. Jako vedlejší produkt glukózaoxidázové reakce vzniká peroxidu vodíku
- V reakci katalyzované peroxidázou reaguje vznikající peroxid vodíku s 4-aminoantipyrinem, který se oxiduje na reaktivní meziprodukt, a ten s další látkou kopuluje na stálé rozpustné barvivo jehož absorbance se měří.
Hodnocení
3,9–5,6 mmol/l nalačno a po jídle nižší než 10 mmol/l
↑ Diabetes
↓ 3 hodiny praktik chemie bez svačiny
Stanovení koncentrace vápníku v séru.
Spektrofotometrické měření barevných komplexů, které vznikají reakcí komplexotvorných látek s kalciem. Např. o-kresolftalexon v alkalickém prostředí s vápenatými ionty poskytuje fialově zbarvený komplex, jehož intenzita zbarvení je úměrná koncentraci vápenatých iontů. Používá se též arsenaso-III
Hodnocení
Sérové kalcium: 2,25–2,75 mmol/l
Vyšší nebo nižší hodnoty mohou být důsledkem dysproteinémie.
Stanovení koncentrace železa v séru.
Reakce železa s komplexotvornou látkou.
- Uvolnění Fe3+ z vazby na transferin pomocí kyselin, např. HCl
- Redukce Fe3+ na Fe2+ kyselinou askorbovou
- Reakce Fe2+ s komplexotvorným činidlem (ferrozin) obsahujícím reaktivní skupiny -N=C-C=N- za vzniku barevného komplexu
Hodnocení
- muži: 9–29 μmol/l
- ženy: 7–28 μmol/l
↑ hemochromatóza, hemolýza
↓ krevní ztráty, narušená absorpce
Stanovení katalytické koncentrace ALT v séru.
- Podobně jako v případě AST vyžaduje pracovní postup 5–15 minutovou preinkubaci séra v reakční směsi bez 2-oxoglutarátu. Reakce je startována 2-oxoglutarátem.
- ALT katalyzuje reakci alaninu na pyruvát.
- Přidáním NADH a laktátdehydrogenázy se pyruvát redukuje na laktát. Redukce je provázena úbytkem NADH, což se projeví poklesem absorbance při 334, 340 nebo 365nm. Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance.
Hodnocení
muži do 0,8 a ženy do 0,6 ukat/l (pamatujte si že pod 1)
Zvýšené hodnoty odráží poškození jaterních buněk.
Stanovení katalytické koncentrace AST v séru.
- AST katalyzuje reakci, při které se tvoří oxalacetát
- Vzniklý oxalacetát je malátdehydrogenázou redukován na malát za současné oxidace NADH na NAD+. Aktivitu AST stanovíme kineticky na základě rychlosti úbytku NADH v průběhu reakce měřením absorbance při 334, 340 nebo 365nm. Katalytická koncentrace AST je úměrná poklesu absorbance.
- Reakce startuje po preinkubaci přidáním 2-oxoglutarátu a po krátké lag fázi monitorujeme změnu absorbance několik minut v minutových intervalech. Protože počáteční absorbance reakční směsi má vyšší hodnotu, doporučuje se provádět odečet proti slepé zkoušce, kterou může být např. roztok dvojchromanu draselného.
Hodnocení
muži do 0,85 μkat/l, ženy do 0,60 μkat/l (pamatujte si že pod 1)
Zvýšené hodnoty odráží poškození jaterních buněk ale také buněk myokardu, kosterních svalů apod.
Stanovení katalytické koncentrace γ-glutamyltransferázy v séru.
Stanovení kopíruje reakci, kterou GGT katalyzuje v organismu: přenos γ-glutamylového zbytku ze substrátu (L-γ-glutamyl-p-nitroanilid nebo L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid) na akceptor glycylglycin. V průběhu reakce se po přenosu γ-glutamylového zbytku na akceptor uvolňuje barevný p-nitroanilin (ze substrátu L-γ-glutamyl-p-nitroanilidu) nebo 5-amino-2-nitrobenzoát (ze substrátu L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilidu), jejichž přírůstek je přímo úměrný aktivitě GGT ve vyšetřovaném vzorku.
Hodnocení
Fyziologické hodnoty fS-GGT: muži 0,14–0,84 μkat/l, ženy 0,14–0,68 μkat/l (pamatujte si, že pod 1)
Zvýšené GGT značí obstrukci ve žlučových cestách a zvýšené je rovněž při abusu alkoholu
Stanovení katalytické koncentrace alkalické fosfatázy v séru.
Principem reakce je katalýza štěpení 4-nitrofenylfosfátu na 4-nitrofenol a fosforečnan, kdy sledujeme nárůst absorbance na spektrofotometru při 405nm v několika minutových intervalech, která je přímo úměrná příbytku množství 4-nitrofenolu a tudíž přímo úměrná aktivitě ALP.
Hodnocení
muži 0,7–2,1 μkat/l a ženy 0,9–2,2 μkat/l
Stejně jako GGT je ALP marker cholestázy. Zvýšená je také u některých kostních chorob
Spektrofotometrie mozkomíšního moku.
obsáhleji v originálním návodu zde
Spektrofotometrie mozkomíšního moku ve viditelné části spektra (370-600nm) umožňuje rozlišit na základě rozdílných absorpčních maxim:
- oxyhemoglobin (při 415nm)
- methemoglobin (při 405nm)
- bilirubin (při 420-460nm)
Hodnocení
- Fyziologicky - plochá nebo mírně klesající křivka
- Oxyhemoglobin
- Absorpční maximum při 415nm a dva menší vrcholy při 540 a 575nm
- čerstvé subarachnoidální krvácení
- Methemoglobin
- Maximum při 415nm se posouvá směrem ke kratším vlnovým délkám s maximem při 406nm. Nalézáme ho jako součást sumačních křivek, kde se absorbance jednotlivých pigmentů překrývají. Dá se však prokázat přídavkem KCN do vzorku. Pokud je přítomen methemoglobin, vznikne kyanmethemoglobin s absorpčním maximem v oblasti 419nm; v případě, že se nevyskytuje, ke změně nedojde.
- Známka starších změn hemoglobinu
- Bilirubin
- Absorbční maximum při 460nm, konjugovaný bilirubin má max v oblasti 420nm
- Starší krvácení do likvorových cest
