Uživatel:Leito23/Pískoviště

DNA čipy

DNA čip (často i v našem prostředí nazýván anglickým názvem DNA microarray) je technologie umožňující molekulárně-biologické analýzy výrazně paralelního rázu, předevíšm analýzu exprese genů. DNA čip je destička (povětšinou skleněná nebo silikonová), s mnoha (běžně desetitisíci, výjimečně až miliony) vzorky jednovláken DNA oligonukleotidů. Těmto vzorkům se říká vlastnosti (features) a každý z nich obsahuje několik molekul jednoho konkrétního DNA oligonukleotidu. Po kontaktu takovéto destičky s testovaným vzorkem - směsí označených DNA oligonukleotidů - molekuly vzorku (nazývané cílové) hybridizují s komplementárními molekulami přichycenými na destičce. Poté jsou (typicky na bázi fluorescence, příp. radioaktivity) detekována místa, kde došlo k hybridizaci, a je tak zjištěno, jaké molekuly oligonukleotidů vzorek obsahoval. I jediný experiment produkuje velké množství dat, proto je pro porozumnění výsledků takřka vždy nutné použít metody bioinformatiky. V dnešní době existuje několik firem, produkujících DNA čipy komerčně (např. Affymetrix, Agilent Technologies, Eppendorf či Illumina), rovněž jsou ale hojně vytvářeny přímo ve výzkumných laboratořích pro vlastní potřebu. Obdobou DNA čipů jsou RNA čipy a proteinové čipy.

Průběh testování

DNA čip je založen na principu párování komplementárních bází nukleotidů - spojení vodíkovými můstky. Možných postupů při experimentu je více, tradiční experiment pro zjištění genů exprimovaných v jedné buňce v daném okamžiku lze popsat zhruba takto:

1. Vytvoření DNA čipu: Vybrané DNA oligonukleotidy - jednovlákna (například části genů, genové reportéry) známých sekvencí, nazývaná sondy, jsou speciálními metodami přichyceny k povrchu destičky pevnou kovalentní vazbou. Vždy několik stejných molekul na jednom místě tvoří tzv. vlastnost. Vlastnosti jsou na destičce prostorově odděleny.
2. Vytvoření vzorku: Typickým příkladem vzorku je všechna mRNA přítomná v určité buňce v určitém okamžiku. Vzorek musí být nejdříve purifikován ("vyčištěn"), (např. elektroforézou, PCR se specifickými primery) poté je reversní transkripcí převeden do cDNA. Dále může proběhnout amplifikace pomocí PCR pro zajštění dostatečného počtu molekul požadovaných typů ve vzorku a dělení molekul cDNA na kratší pomocí restrikčních endonukleáz. Během reverzní transkripce, PCR amplifikace či po nich probíhá nezbytný krok označení molekul. Ke každé molekule je připojeno několik molekul (typicky zhruba jedna na každých 60 bází) fluorescentní (popř. jiné, např. radioaktivní) látky, jejíž přítomnost, popř. množství bude možno později detekovat. Typickými fluorescenčními látkami používanými pro tyto pokusy jsou fluorofory. Molekuly vzorku jsou před aplikací na čip denaturovány. Výsledným vzorkem je tedy směs jednovláken DNA označených detekovatelnou látkou.
3. Hybridizace vzorku s čipem: Po kontaktu s DNA čipem molekuly vzorku hybridizují s komplementárními sondami (molekulami na čipu). Čím větší je sekvenční podobnost (resp. komplementarita, viz nukleová báze) sond s molekulami vzorku, tím větší počet vodíkových můstků mezi nimi vznikne a tím pevnější je vazba.
4. Omytí čipu: Po omytí zůstanou na čipu sondy, pevně přichycené kovalentní vazbou k jeho povrchu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. Molekuly vzorku přichycené na sondách nedostatečným počtem vodíkových můstků, tedy nedostatečně sekvenčně podobné, jsou odplaveny.
5. Skenování čipu: Po excitaci laserem vyzáří molekuly barviva (způsob s použitím fluorescentního barviva) přítomné na molekulách vzorku přichycených na sondách světlo určité vlnové délky. Světlo vyzářené každou vlastností je detekováno.
6. Zpracování výsledků: Předchozím postupem získáme informaci o tom, ke kterým sekvencím uchyceným na čipu existovaly komplementární sekvence ve vzorku. Podle intenzity vyzářeného světla lze určit i množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku, běžně se ovšem pracuje pouze s relativním množstvím. Jsou tedy pouze porovnávána množství světla vyzářená jednotlivými vlastnostmi pro zjištění poměrů, v jakých byly jednotlivé sekvence ve vzorku přítomny. Zjištění absolutní koncentrace jednotlivých sekvencí ve vzorku je problematické. Charakter získaných dat vyžaduje pokročilé počítačové zpracování. Nejdříve je třeba digitální zpracování obrazu, získaná data jsou potom analyzovány metodami bioinformatiky.

Dvoukanálový test

Popsaný postup může být upraven požitím směsi dvou vzorků (např. ze zdravých a rakovinných buněk či z buněk jednoho druhu v různých podmínkách) označených různými barvivy (typicky červeným a zeleným). Výsledkem je potom relativní informace o rozdílu v expresi genů mezi vzorky, lze tak jednoduše zjistit například které geny jsou vlivem nemoci v buňkách podexprimované a které nadexprimované. Tímto způsobem bude použit pouze jeden místo dvou čipů, což snižuje cenu. Nevýhodou je však horší porovnatelnost výsledků s jinými experimenty a také fakt, že pokud je jeden ze vzorků nekvalitní, znehodnotí i analýzu druhého, byť kvalitního vzorku.

Výroba

Exisuje mnoho variant postupů při výrobě DNA čipů, dva základní přístupy jsou tyto:

1. Nanášení kapek na podklad: Pomocí přesného robotického zařízení jsou na určená místa na podkladu postupně nanášeny mikroskopické kapky směsi obsahující vždy molekuly jednoho typu, čip tak vzniká postupně, jedna vlastnost za druhou. Tento přístup je vhodný na při potřebě delších oligonukleotidů.
2. In situ syntéza oligonukleotidů: Tento princip výroby využívá fotolitografii. Celá podkladová destička je nejdříve zakryta inertním materiálem, ten je poté na požadovaných místech odkryt a destička je vnořena do směsi obsahující pouze nukleotidy jednoho druhu. Ty se po jednom přichytí na odkrytá místa. Destička je opět zakryta, odkryta na dalších místech dle plánu a ponořena do směsi s dalším nukleotidem. Takto jsou postupně syntetizovány celé požadované sekvence. Tento přístup je vhodný na čipy s kratšími oligonukeotidy.

Proteinové čipy

Podstatou čipů pro detekci proteinů je jejich imobilizace na pevný povrch (tzv. substrát). Nejčastěji se používá destička nebo fólie vyrobená ze skla, silikonu, teflonu, plastů nebo běžných syntetických polymerů (polystyren, nitrocelulóza, olyvinylidendifluorid apod.). Proteiny mohou být imobilizovány na substrát nebo jeho modifikovaný povrch fyzikální sorpcí (nekovalentní interakcí) nebo kovalentní vazbou. Velmi často je na povrch substrátu speciální technologií nanesena (napařena) vrstva zlata, hliníku nebo jiného kovu. Na tuto anorganickou vrstvu se nanáší organický film. Vlastnosti organického filmu by měly být takové, aby po nanesení vzorku nedocházelo ke ztrátě jeho kompaktnosti a dehydrataci. K omezení dehydratace proteinů na povrchu čipu se používá agaróza, dextranové a polyakrylamidové gely nebo jiné hydrofilní polymery (např. poly-L-lysin). Hydrofilní vlastnosti organického filmu jsou velmi důležité, jelikož obecně přispívají k afinitě mezi proteinem a povrchem čipu. Většina proteinů disponuje hydrofilními aminokyselinami na svém povrchu a hydrofobní aminokyseliny jsou orientovány do vnitřní struktury molekuly. Hydrofilní proteiny tak mohou být přitahovány hydrofilním povrchem čipu. V ideálním případě tvoří organický film homogenní monovrstva molekul (SAM: Self-Assembled Monolayer) s volnými hydrofilními konci. Důležitou součástí organického filmu jsou také specifická vazebná místa pro afinitní značku proteinu. Proces imobilizace proteinu na organický film je klíčovým krokem v konstrukci čipu. To, s jakou efektivitou a afinitou se bude protein vázat, je výsledkem optimalizace komplexní procedury zahrnující např. volbu vhodných vazebných pufrů nebo upravení teploty a pH. Mnohdy je tato práce usnadněna znalostí konformace a fyzikálně-chemických vlastností vazebného místa (disociačních konstant) proteinu.

Aplikace čipů v proteomice

Výsledky, které byly doposud získány v základním výzkumu, jsou s úspěchem aplikovány v komerčních testech. Podobně jako u DNA/RNA čipů, které umožňují identifikaci velkého množství DNA nebo transkriptů (mRNA) během jedné analýzy, je snaha využít čipy pro mapování proteomů. Aplikovatelnost čipů pro identifikace většího počtu proteinů byla prvním impulzem pro přenos technologie čipů do komerční sféry. Separační techniky v on-line spojení se systémem čipů se využívají při analýze složitých matricí, které znesnadňují vazbu detekovaných proteinů na povrch čipu. Aplikace čipů je orientována do dvou oblastí proteomiky.

1. Využití čipů k mapování proteomů: K takovému účelu slouží protilátkou značené čipy s imobilizovanými protilátkami. Proces detekce je automatizován fluorescenčním skenerem. Čipy s imobilizovanou protilátkou jsou využitelné pro detekci série enzymů, jejichž přítomnost indikuje např. přítomnost funkční metabolické dráhy. Jsou-li k dispozici potřebné protilátky, je aplikovatelnost těchto zařízení velmi vysoká vzhledem k možnosti identifikovat neomezený počet proteinů. Kvantifikace navázaných proteinů je nepřesná (semikvantitativní) a umožňuje získat informaci o přítomnosti nebo naopak nepřítomnosti proteinu ve vzorku.
2. Studium chemických/fyzikálních modifikací a interakcí proteinů: Jedná se o interakce se širokým spektrem biomakromolekul nebo i nízkomolekulárních ligandů. Podmínkou je, aby byl imobilizovaný protein biologicky aktivní a aby

podmínky (pH, koncentrace solí, teplota atd.), kterým je protein na povrchu čipu vystaven, umožnily jeho vazbu se studovanou látkou. Z hlediska molekulární biologie se soustřeďuje zájem vědců na problematiku sledování interakcí protein-DNA, protein-RNA, protein-protein, protein-cukr a protein-ligand (léčivo, signální molekula, toxin atd.). Proteinové čipy je možné aplikovat i při sledování posttranslačních modifikací proteinů (fosforylace, oxidace atd.) nebo studiu jejich konformačních (denaturace/renaturace) změn. Ke komerčnímu využití jsou k dispozici i další proteinové čipy. Jako příklad lze uvést CM5 čip, kde je detekce proteinu prováděna hmotnostní spektrometrií. Proteinový čip CM5 je vyroben ze skla, které je potaženo 50 nm filmem ze zlata, k němuž je přes thiohydroxyalkan vázán dextran modifikovaný streptavidinem. Zlato napařené na povrch substrátu je velmi často používáno proto, že nepodléhá oxidacím jako jiné kovy.