Stanovení počtu buněk a jejich viability
Z WikiSkript
Trypanová modř 0,4 % v izotonickém fosfátovém pufru pH 7,4 Trypanová modř je jed!
Princip[upravit | editovat zdroj]
Trypanová modř je z živých buněk aktivně transportována přes buněčnou membránu. Po smísení buněčné suspenze s roztokem tohoto barviva proto živé buňky zůstávají světlé, zatímco mrtvé se obarví na modro.
Postup[upravit | editovat zdroj]
- K 0,5 ml dobře promíchané buněčné suspenze se přidá 0,5 ml roztoku trypanové modři.
- Po 5 až 15 minutách se suspenze dobře promíchá a pomocí 50 μl automatické pipety se jí naplní obě poloviny Bürkerovy komůrky. Je třeba aplikovat takové množství vzorku, aby se komůrka právě naplnila, roztok nesmí přetékat do okolních žlábků.
- Pod světelným mikroskopem se při nejmenším zvětšení počítají zvlášť živé (bezbarvé) a mrtvé (modré) buňky. Počítá se nejprve 5 čtverců (4 rohové a středový) 1 × 1 mm v jedné polovině komůrky. Je-li celkový počet buněk menší než 100, počítají se buňky i v dalších 5 čtvercích ve druhé polovině komůrky. Za hranici čtverce se považuje prostřední linka z trojité čáry. Z buněk, které leží na okraji čtverce, se počítají ty, které se i jen dotýkají levého nebo horního okraje, a naopak se nepočítají buňky, které se i jen dotýkají pravého nebo dolního okraje.
- Počet buněk se vypočítá podle vzorce , kde:
- P je počet buněk na 1 ml suspenze
- N je celkový počet buněk
- D = 2 (ředění suspenze)
- H = 0,1 (hloubka komůrky v mm)
- S je počet čtverců
- Vypočítá se podíl živých buněk v procentech.
Odkazy[upravit | editovat zdroj]
Zdroj[upravit | editovat zdroj]
- VEJRAŽKA, M.: Základní techniky práce s tkáňovými kulturami. Praha, 2004.