Přímá diagnostika dědičných chorob analýzou nukleových kyselin

Umožňuje zachytit a identifikovat mutaci zodpovědnou za onemocnění u postižených a ve sledované rodině.

Podmínkou je znalost lokalizace genu a znalost jeho standardní sekvence. Nabízejí možnost odhalení heterozygotního přenašeče mutované alely i u jedince, v jehož příbuzenstvu postižený jedinec není znám. Vyšetření začíná v úsecích genu s nejvyšším počtem mutací.

Metody, které zachytí jakoukoliv odchylku od standardní sekvence DNA

Většina metod využívá k detekci PCR. U většiny genů nelze provést vyšetření v jedné reakci a to z důvodu jejich velikosti. Pomocí zvolených primerů jsou postupně amplifikovány jednotlivé úseky genu.

Analýza heteroduplexů

Obecné schéma heteroduplexní analýzy

Založena na detekci chybného párování bazí (mismatch). K tomu dochází při hybridizaci komplementárního vlákna DNA standardního a mutantního typu, kdy vznikají hybridní molekuly DNA – heteroduplexy. Vytvářejí se v místech s delecemi nebo inzercemi několika bazí. Principem je rozdílná elektroforetická mobilita dsDNA v případě dokonalé a nedokonalé komplementarity.

 Podrobnější informace naleznete na stránce Heteroduplexová analýza.

DGGE

Průběh DGGE a CG svorka

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Vychází z rozdílného bodu tání v závislosti na složení dsDNA. Heteroduplexy a homoduplexy – migrují při elektroforéze gelem s lineárně se zvyšujícím množstvím denaturačních činidel. V místě, kde koncentrace denaturačních činidel odpovídá teplotě, při které dochází k částečné denaturaci DNA, se migrace parciálně denaturovaného úseku DNA značně zpomalí nebo zastaví. DNA heteroduplexy jsou méně stabilní a proto se jejich vlákna částečně separují dříve než vlákna homoduplexů – zpomalí svou mobilitu v gelu a migrují do jiné pozice.

 Podrobnější informace naleznete na stránce DGGE.

High Resolution Melt

Detekce mutací a polymorfismů v dsDNA. Výhodou metody je rychlost a levnost.

Postup: PCR - HRM analýza = zvýšení teploty na teplotu tání, což vede k separaci vláken DNA. Proces je možné zachytit v reálném čase. Navázání fluorescenčního barviva na DNA.

Chemické nebo enzymatické štěpení heteroduplexů

Technika mismatch cleavage. Štěpení jednovláknového místa – tam, kde není úplná komplementarita obou vláken. Elektroforesa v denaturovaném gelu – průkaz přítomnosti štěpených nebo neštěpených fragmentů testované DNA.

Záchyt velkých delecí

Delece postihující celý exon nebo gen nejsou běžnými metodami identifikovatelné. Lze je odhalit pomocí metod Southern blotting. V případě rozsáhlých delecí lze využít metoda FISH.

Real time PCR

Zjištění přesného počtu kopií určitých sekvencí nukleové kyseliny v buňkách. Umožňuje monitorovat množství produktu DNA v každém cyklu PCR. Např. při zjištění hladiny virové infekce, počtu kopií onkogenu.

DNA čipy

Dvoukanálový DNA čip

Nejslibnější z moderních metod. Lze využít v kombinaci s počítačovým hodnocením výsledků.

 Podrobnější informace naleznete na stránce DNA čipy.

Následující metody se již nepoužívají!

SSCP metoda

Single Strand Conformation Polymorphism Analysis. Založena na analýze ssDNA (jednovláknová DNA), využívá PCR. Amplifikovaný úsek DNA je denaturován a nanesen na polyakrylový gel. Je-li ve vyšetřovaném úseku DNA přítomna mutace, jednovláknová DNA zaujme odlišnou konformaci (odlišná pohyblivost této DNA v gelu). Vlákna je možné vizualizovat – radioaktivní značení oligonukleotidů pro PCR.

 Podrobnější informace naleznete na stránce SSCP.

RT-PCR

Výchozím materiálem je izolovaná RNA, která je konvertována do cDNA pomocí reverzní transkriptázy a amplifikovaná PCR. Poté je testována na přítomnost mutací. Umožňuje testovat větší úseky. Zachytí aberantní sestřih nebo aktivaci kryptického místa sestřihu, které jsou běžnými metodami velmi těžko identifikovatelné.

PTT

Protein Truncation Test. Metoda specifická pro detekci mutací, které mají za následek vznik předčasného terminačního kodonu a tím zkrácení proteinového produktu. Z izolované mRNA je reverzní transkripcí a následnou PCR připravena cDNA, dále je provedena transkripce a translace in vitro. Velikost proteinového produktu testována elektroforeticky a srovnána s délkou standardního produktu. Používá se pro detekce frameshift a nonsense mutací.

Sekvenování DNA

Výsledek sekvenace úseku DNA automatickým sekvenátorem

Využití zejména v závěrečné fázi vyšetření. Odhalí odchylky v nukleotidové sekvenci DNA.

Sangerova metoda

Nejčastěji používaná.

Základem je použití směsi standardních deoxynukleotidtrifosfátů (dNTPs) a modifikovaných dideoxynukleotidtrifosfátů (ddNTPs) při přípravě úseku DNA, který bude sekvenován. Modifikovaný ddNTPs má za následek ukončení syntézy DNA. Výsledkem syntézy DNA je série různě dlouhých molekul DNA, které se v délce liší vždy o jeden nukleotid.

Celý proces probíhá ve 4 separátních enzymových reakcích. Každá obsahuje - templátovou DNA v jednovláknové podobě, DNA-polymerasu, primer, 4 dNTPs a modifikovaný nukleotid dideoxynukleotidtrifosfát (ddNTPs). V každé ze 4 reakcí je jiný ddNTP - ddATP, ddGTP, ddCTP, nebo ddTTP.

Po skončení sekvenace jsou molekuly DNA separovány kapilární elektroforézou - produkty procházejí kapilárou, kde se dělí dle velikosti. Jestliže je do sekvenační reakce přidán dNTP označený radioaktivně - je možné vzniklou DNA detekovat na rtg filmu v podobě viditelných pruhů všech 4 linií.

Metody detekce specifických mutací

Lze je použít tam, kde má většina postižených v populaci jednu nebo omezený počet mutací Např. srpkovitá anémie, cystická fibróza.

Mutačně-specifická analýza RFLP

V případě, kdy mutace vytváří nebo ruší restrikční místo pro určitý restrikční enzym a zároveň je příčinou onemocnění. Metodou PCR dochází k amplifikaci úseku DNA s restrikčním místem. Následuje restrikce specifickými restrikčními enzymy a gelová elektroforéza.

ASO

Alelově Specifické Oligonukleotidy. Syntetizovány k detekci bodové nukleotidové diference v sekvenci DNA.

Diagnostika expanze trinukleotidů

DNA diagnostika v případě Huntingtonovy choroby. Amplifikace (PCR) v oblasti genu s vysokým obsahem repetic (CAG)n. Následuje elektroforéza v polyakrylamidovém gelu. Počet repetic souvisí s rozvojem onemocnění. Při detekci Syndromu fragilního X je možné použít PCR pro detekci standardních nebo premutantních alel. Plné mutace jsou příliš dlouhé.

Odkazy

Související články

• Vyhledávání mutací
• PCR

Zdroj

• ŠTEFÁNEK, Jiří. Medicína, nemoci, studium na 1. LF UK [online]. [cit. 2009]. <https://www.stefajir.cz/>.

Použitá literatura

• KOHOUTOVÁ, Milada. Lékařská biologie a genetika (II. díl). 1. vydání. Praha : Nakladatelství Karolinum, 2013. 202 s. ISBN 978-80-246-1873-9.