Mikroskopie pro procházející světlo

Princip

Mikroskopie pro procházející světlo je založena na tzv. diaskopickém osvětlení, což znamená, že pozorovaný objekt je umístěn mezi světelný zdroj a objektiv. Světlo jím tak musí před vstupem do optické soustavy objektivu projít; podmínkou je tedy (alespoň částečná) průhlednost preparátu. V praxi to znamená, že vzorek prosvěcujeme proti směru pozorování (srovnání viz mikroskopie pro dopadající světlo).

Pozorování v procházejícím světle můžeme dělit na pozorování ve světlém poli a pozorování v tmavém poli.

Světlé pole

Průchod světla mikroskopem pro tmavé pole

Pozorování ve světlém poli je nejjednodušší (a nejstarší) technikou světelné mikroskopie. Osvětlení je zajišťováno bílým světlem, kužel paprsků prochází vzorkem a vstupuje do objektivu. Jeho nevýhodou je nízký kontrast při pozorování většiny biologických vzorků (protože jen málo z nich výrazněji absorbuje světlo), a proto je často nutné použití různých barvících technik. Naopak výhoda spočívá v již zmíněné jednoduchosti, a proto je tato metoda velmi oblíbená.

Kromě již zmíněného barvení se pro zvýšení kontrastu využívá:

• šikmé osvětlení − osa osvětlení svírá ostrý úhel s optickou osou mikroskopu, pozorované objekty se vlivem asymetrického zastínění jeví plasticky;
• fázový kontrast − metoda, která převádí fázový posun světla po průchodu vzorkem v amplitudovou modulaci (a tedy rozdíl v intenzitě pozorovaného světla), využívá interference světla (viz interferenční mikroskopie);
• Hoffmanův modulační kontrast je rozšířenou metodou používanou např. při fertilizaci in vitro; je založen na pozorování fázových objektů při šikmém osvětlení;
• polarizované světlo − viz polarizační mikroskopie.

Tmavé pole (zástin)

Při pozorování v temném poli nedopadá světlo procházející rovinou vzorku přímo do objektivu, a proto je zorné pole tmavé. Toho lze docílit zastíněním výstupní čočky kondenzoru clonou pro tmavé pole (popřípadě volbou speciálního kondenzoru určeného pro tento druh pozorování), která odstíní centrální část světelného kužele a ponechá jen vnější prstenec paprsků. Většina z nich projde vzorkem přímo, ale nevstoupí do pupily objektivu, poněvadž ji jednoduše minou. Část světla se však při průchodu vzorkem rozptýlí, projde objektivem a vytváří obraz. Největší nevýhoda této techniky tkví v tom, že pro tvorbu obrazu je využita jen malá část světelné intenzity zdroje, který proto musí mít dostatečně vysoký výkon. Výhodou je významné zvýšení kontrastu obrazu (oproti světlému poli) a opět relativní jednoduchost.

Rheinbergovo osvětlení je zvláštní metodou pozorování v tmavém poli. Před kondenzor se vloží průhledný barevný filtr složený ze dvou částí odlišné barvy − centrálního terčíku a vnějšího prstence. Tím získá pozadí barvu terčíku a obraz, tvořený světlem rozptýleným strukturou vzorku, barvu prstence.

Odkazy

Související články

• Mikroskopie pro dopadající světlo
• Konstrukce a funkce světelného mikroskopu

Použitá literatura

• NAVRÁTIL, Leoš a Jozef ROSINA. Medicínská biofyzika. Vyd. 1. Praha: Grada, 2005, 524 s. ISBN 80-247-1152-4.
• WIKIPEDIA, The Free Encyclopedia. Microscopy [online]. Poslední revize 2015-04-08, [cit. 2015-04-11]. <https://en.wikipedia.org/wiki/Microscopy>.

• OPTOTEAM,. Základní metody světelné mikroskopie [online] . Brno, 2004. 65 s. Dostupné také z <http://www.are.cz/documents/ZAKLADNI_METODY_SVETELNE_MIKROSKOPIE.pdf>.