Metody chromosomálního vyšetření

Příprava cytogenetického materiálu, kultivace buněk

• nedělící se buňka je ve stádiu interfáze – chromosomy despiralizovány jen s úseky heterochromatinu – chromomerami, které jsou patrné
• chromosomální vyšetření jsou možná jen v některých stádiích buněčného dělení, kdy jsou chromosomy spiralizované a po zpracování pozorovatelné v optickém mikroskopu
• pro kvalitní preparáty třeba tkáň s dostatečnou proliferační intenzitou (vyšší mitotický index – poměr počtu buněk v mitóze : všech buněk vzorku)
• v tkáních s přirozeně vysokou mitotickou aktivitou (kostní dřeň, choriové klky, nádory) je možné přímé zpracování buněk

Ve většině tkání nutná kultivace (periferní krev 72 hodin, některé tkáně i týdny)

• v lahvičkách s kultivačním médiem s přídavkem séra s růstovými faktory

• kultury vyžadují konstantní teplotu 37°, konstantní pH, dlouhodobé kultury i 5% oxidu uhličitého v atmosféře termostatu

Pro postnatální analýzu se kultivují lymfocyty periferní krve stimulované mitogenem (obvykle fytohemaglutinin) – stimulace blastické transformace lymfocytů T. Prenatálně se nejčastěji vyšetřuje plodová voda (amniocentéza, 16.-20. týden), fetální krev (kordocentéza, po 20. týdnu) nebo choriové klky (okolo 12. týdne).

Buňky získané biopsií (fibroblasty, nádory) musí být nejprve mechanicky nebo enzymaticky rozvolněny a jejich mitotická aktivita se vyvolává růstovými faktory telecího séra a bývá pomalejší.

• vyšetření chromosomů v meiose je obtížnější a standardně se neprovádí
• chromosomální vyšetření vajíček, pólových tělísek i buněk embryí je prováděno v souvislosti s asistovanou reprodukcí

Vlastní zpracování buněčné kultury

Zahajuje se přidáním mitotického jedu – kolchicinu (alkaloid) nebo jeho syntetických derivátů (colcemid) – několik minut či hodin před zpracováním. Tyto sloučeniny rozrušují aparát vláken dělícího vřeténka, jež se napojují k centromerám – zabrání se seřazení v ekvatoriální rovině a oddělení sesterských chromatid = dělení se zastavuje v metafázi (c-metafáze – kolchicin).

Dalšího zlepšení rozložení chromosomů dosáhneme během zpracování působením hypotonického roztoku 0,075 M KCl – kvůli osmotickým jevům dojde k rozvolnění buněčného obsahu a individualizaci jednotlivých chromosomů.

Následuje fixace směsí kyseliny octové a metanolu (1:3) pro zachování vnitřní struktury chromosomů, získaná suspenze se nakape na podložní sklo a preparáty se dále barví.

Cytogenetické barvící metody

Z mnoha možností se v praxi uplatňuje jen několik postupů barvení

Klasické konvenční barvení

= barvení jedním, obvykle Giemsovým, barvivem

homogenně zbarvené chromosomy vhodně pro hodnocení počtu, hrubších strukturních odchylek a získaných chromosomálních aberací – chromosomálních a chromatidových zlomů.

Pro identifikaci jednotlivých chromosomů v karyotypu a hodnocení jejich struktury a přestaveb jsou využívány:

Diferenciální techniky barvení

– pruhování (banding) - dosáhne se střídání světlých a tmavých proužků po celé délce chromosomů, pruhy jsou rozsáhlé struktury 5-10 Mb – stovky genů.

Molekulární podstata pruhování odráží funkční organizaci genomu, zastoupení jednotlivých bazí a přidružených proteinových molekul ve vnitřní struktuře chromozomu. Strukturní proužky je možné vyvolat pouze u vyšších obratlovců, u jiných druhů zatím nelze využít

Q pruhování (quinacrine)

• barvení fluorescenčním barvivem chinakrinem bez předchozího chemického působení
• nejstarší metoda, dnes již využívaná výjimečně
• preparáty je nutno pozorovat pod fluorescenčním mikroskopem a fotograficky dokumentovat
• rozložení jasně zářících Q proužků odpovídá tmavým G pruhům

G pruhování (Giemsa)

• barvení Giemsovým barvivem po ovlivnění chromosomů denaturačním činidlem, obvykle trypsinem
• tmavé G-pruhy odpovídají oblastem relativně genově chudým s převažujícím zastoupením AT bází a pozdně se replikujícím
• naopak G-negativní světlé pruhy jsou oblasti bohaté na GC páry s časnou replikací a vyšší genovou hustotou
• G pruhování představuje základní metodu vyšetření člověka

R pruhování (reverse)

• vzniká po denaturaci a následné renaturaci DNA při alkalickém působení za vysoké teploty
• Giemsovým barvivem se poté barví tmavě úseky při G pruhování světlé a světle úseky při G pruhování tmavé
• často se užívá pro zvýraznění telomer

Selektivní techniky barvení

= barvení specifických oblastí chromosomů

C pruhování

• barvení Giemsou po denaturace v alkalickém prostředí
• zvýrazňuje oblasti konstitutivního heterochromatinu – centromery a heterochromatinové úseky chromosomů 1,9,16 a Y

Ag-NOR barvení

• dusičnanem stříbrným
• znázorňuje oblasti organizátorů jadérka na akrocentrických chromosomech
• barví se pouze organizátory, které se v předchozí interfázi aktivně účastnily formace jadérka

výměny sesterských chromatid (SCE)

• umožňuje odlišit DNA syntetizovanou před prvním, druhým a dalšími cykly buněčného dělení
• inkorporace bromdeoxyuridinu (BrdU), analogu thymidinu, během S-fáze do nově syntetizované molekuly DNA, tedy do sesterské chromatidy během replikace
• následné barvení Giemsou zbarví bledě chromatidu s BrdU (inhibuje barvitelnost) a tmavě chromatidu původní
• metoda se užívá pro testování mutagenních účinků chemických látek a pro diagnostiku syndromů s výraznou lomivostí chromosomů (Bloomův syndrom)

Kvalita cytogenetického vyšetření závisí na stupni spiralizace pozorovaných chromosomů a jejich délce, počtu hodnotitelných pruhů apod. – rozlišovací schopnosti vyšetření

• v c-metafázi rozlišíme 400-450 pruhů v haploidní sadě pro orientační vyšetření
• přesnější analýza je možná při 550 pruzích
• někdy je třeba až 850 pruhů
• větší počet buněk v prometafázi získáme synchronizací buněčného dělení a kratším působením kolchicinu
• synchronizaci navodíme působením určitých látek nebo změnou teploty
• tento způsob přípravy se označuje jako HRT – technika s vysokou rozlišovací schopností – jemné strukturální přestavby, zejména mikrodelece

Odkazy

Související články

• Indikace chromozomálního vyšetření
• Barvení chromozomů