Frakcionace buněk

Frakcionace buňky je metoda pro získání částí buňky schopných samostatné funkce. Používá se pro oddělení organel a makromolekul pro následnou analýzu jejich složení a funkcí. Jednotlivé makromolekuly mohou být poté dále izolovány a analyzovány, např. pro určení proteinové poruchy. Postup frakcionizace se skládá ze dvou částí: homogenizace buňky a purifikace složek.

Homogenizace buněk

Homogenizace buněk je proces při kterém dojde k rozrušení membrány buňky a uvolnění buněčných součástí do roztoku. Můžeme jí dosáhnout několika metodami. Orientačně se rozdělují mezi hrubé a jemné metody. Jemné metody jsou používané například pro buněčné kultury. Oproti tomu hrubé metody jsou používané pro pevnější struktury, které vyžadují určitou míru mechanického poškození, jako například pojivová nebo kožní tkáň.

Buněčný homogenizér Emulsiflex

Hrubé metody

Kuličková homogenizace

Při této metodě využíváme drobné kovové nebo skleněné kuličky, které se v určitém poměru smísí s buňkami. Následným mícháním nebo třepáním dojde nárazy kuliček k rozdrcení membrán. Metoda je velice jemná, ale bohužel časově náročná.

Ultrazvuk

Opakovanými ultrazvukovými rázy dochází k rozdrcení membrán. Nevýhodou této metody je, že generuje vysoké množství tepla, které může poškodit funkci součástí buňky a tím celý postup znehodnotit. Pro izolaci proteinů se proto využívá zmrazený preparát.

Vysoký tlak

Při této metodě jsou buňky drceny vysokým tlakem. Příkladem pro to může být protlačování buněk úzkým otvorem při průchodu kterým buňky prasknou. Využít k tomu můžeme například French press.

Jemné rozmixování

Zmrzlá tkáňová kultura může být rozmixována jemným mixérem, přičemž dojde k mechanickému rozbití buněčné stěny a membrány. Případně můžeme zmrzlý vzorek mechanicky rozemlít.

Jemné metody

Opakované zmražování a tání

Metoda efektivní zejména pro živočišné buňky. Buňky se opakovaně zmrazují (např. tekutým dusíkem) a nechávají roztát. Jelikož led má větší objem než voda, prorazí při zmražení krystalky ledu buněčné membrány a uvolní jejich obsah.

Enzymatické rozrušení

S použitím enzymů specifických pro každou buněčnou kulturu dojde k natrávení složek buněčné membrány, případně stěny. Často se využívá v kombinaci s jinými metodami. Většinou využívaná pro bakterie, kvasinky, fungi, algae i živočišné buňky.

Detergent

S pomocí detergentu dojde k rozpuštění buněčné membrány. Opět se častu využívá ve spojení s jinými metodami, aby se dosáhlo požadovaného účinku. Vhodné pro živočišné buňky.

Osmotická lýza

V prostředí hypotonického roztoku buňka nasaje vodu, nabobtná a eventuálně dojde k jejímu prasknutí, čím se uvolní její obsah do okolí. Opět vhodná metoda pro živočišné buňky, které nemají buněčnou stěnu.

Purifikace složek

Hrubou filtrací (např. přes gázu) můžeme oddělit nehomogenizované buňky od zbytku. Pro pustupné oddělení složek se používá převážně centrifugace a ultracentrifugace. Na základě odlišné velikosti a objemu jednotlivých organel a makromolekul probíhá sedimentace v centrifugách odlišnou rychlostí. Díky extrémnímu gravitačnímu přetížení sedimentují i jednotlivé makromolekuly.

Nejprve sedimentují velké složky jako třeba buněčná jádra. Při vyšších rychlostech mitochondrie, poté zlomky endoplasmatického retikula. Při vyšších rychlostech a delším čase centrifugace se usadí malé váčky, poté ribozomy a menší částečky. Všechny tyto frakce nejsou neprve čisté, ale oddělením usazeniny, jejím resuspendovaním a opětovnou centrifugací je možné je purifikovat. Většinou je však nutné celý proces opakovat několikrát.

Odkazy

Související články

• Centrifugace

Externí odkazy

• French press

Použitá literatura

• NINFA, Alexander, David BALLOU a Marilee BENORE. Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. - vydání. John Wiley & Sons, 2009. 480 s. ISBN 9780470087664.

• ALBERTS, Bruce. Molecular Biology of the Cell. - vydání. Garland, 2004. ISBN 9780815332183.

• Geno Technology, Inc. Cell Disruption Techniques [online]. [cit. 2020-09-28]. <https://info.gbiosciences.com/blog/cell-disruption-techniques-sonication-dounce-homogenizer-more>.