Komparativní genomová hybridizace

CGH (Comparative Genome Hybridization) je molekulárně cytogenetická metoda umožňující analýzu celého genomu v jediném experimentu. CGH vychází z principů metody FISH, při které využíváme 2 vzorky DNA (izolované z vyšetřované tkáně,) odlišně značené fluorochromy. Použití této metody je omezeno na detekci kvantitativních změn genomu (amplifikace/delece).

Postup při Array-CGH

Provedení

Izolujeme 2 vzorky DNA, které jsou následně označeny dvěma rozdílnými fluorochromy metodou nick-translace.

Jeden ze vzorků DNA odebraná z vyšetřované tkáně bývá standardně značen zeleně. Druhý, kontrolní (referenční) DNA se obvykle značí červeně. Tyto sondy jsou pak společně hybridizovány s normálními chromozomy.

Výsledek hybridizace je snímán fluorescenčním mikroskopem, karyotypován a počítačově vyhodnocen.

Vyhodnocení

CGH profil (křivka)

DNA vyšetřovaného jedince a referenční DNA v podstatě “kompetují“ o vazebná místa na chromozomech. V závislosti na tom, zda je určitý úsek vyšetřované DNA amplifikován, či deletován, pak ve výsledku v různých místech chromozomu převládá fluorochrom vyšetřované, nebo referenční DNA.

Počítačovou analýzou získáme hodnoty fluorescenčních intenzit vyšetřované a referenční DNA.

Hodnoty jsou uspořádány do křivky vyjadřující poměr intenzit fluorochromů v průběhu každého chromozomu tzv. CGH profil.

Interpretace výsledků

• hodnoty rovny 1 (chromozomy bez kvantitativních změn),
• hodnoty menší než 0,75 (delece),
• hodnoty větší než 1,25 (amplifikace či duplikace).

Porovnání vzorku s referenční DNA

Použití

Metoda CGH nachází uplatnění především v onkocytogenetice při zjišťování nebalancovaných chromozomálních aberací u nádorů. Umožňuje identifikovat místa v genomu, kde došlo k delecím nebo amplifikacím, a která tak mohou mít souvislost se vznikem či vývojem nádorového onemocnění.

Další využití při asistované reprodukci v rámci preimplantačního genetického screeningu, kdy je umožněna punkce několika blastocyst (tím obejít případný mozaicismus). Aplikace na všechna embrya může zvýšit úspěšnost asistované reprodukce a snížit počet vícečetných gravidit.

U plodů s přítomnými morfologickými změnami na UZ a s normálním karyotypem může CGH přinést doplňující diagnostickou informaci.

Modifikace CGH

Ačkoliv klasická metoda umožňuje celogenomový screening bez potřeby kultivace a detekci aberantních míst bez předešlé znalosti jejich umístění, v mnoha ohledech naráží na komplikace. Omezením klasické CGH je například nezbytná přítomnost alespoň 50 % aberantních buněk ve vzorku, neschopnost detekce aberací bez kvantitativních změn, odlišení diploidních a tetraploidních tumorů, ale také malá rozlišovací schopnost metody (5–10 Mb).

Tyto nedostatky lze řešit modifikací metod CGH (HR-CGH, array CGH).

HR-CGH (High Resolution CGH)

Od klasické CGH se liší ve způsobu softwarového zpracování nasnímaného fluorescenčního obrazu. Využívá dynamické standardní referenční intervaly (přirozená variabilita intenzit fluorescence chromozomových párů) namísto fixních. Dynamické hodnoty se získávají statistickým zpracováním odchylek kontrolních profilů u jedinců s normálním karyotypem.

Výhodou metody je rozlišení na úrovni 4–5 Mb a možnost odhalení aberací i při 20–30% klonálním zastoupení.

Array CGH

Hybridizace fluorescenčně značených sond vyšetřované a referenční DNA s mnoha specifickými sekvencemi DNA (namísto chromosomů). Genom je tak rozčleněn na malé úseky a uspořádán do mřížky (microarray, biočip). Jednotlivé části mají přesně dané umístění a mohou tak představovat jednotlivé geny či jejich části.

Po hybridizaci s vyšetřovanou a referenční DNA je speciálním softwarem spočítán poměr fluorescence pro každý bod mřížky. Tím je umožněno analyzovat amplifikace nebo delece několika tisíc genů najednou, s rozlišovací schopností pod 100 kb. Tím se array CGH posouvá na úroveň molekulární diagnostiky.

Odkazy

Související články

• Nádorová cytogenetika
• Molekulární cytogenetika

Externí odkazy

• NCBI SKY/M-FISH & CGH Database

Použitá literatura

• KOČÁREK, Eduard, Martin PÁNEK a Drahuše NOVOTNÁ. Klinická cytogenetika I.: úvod do klinické cytogenetiky, vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 1.. vydání. Praha : Karolinum, 2006. 120 s. ISBN 80-246-1069-8.

• NEČESALOVÁ, Eva. Využití metody HR-CGH pro molekulárně cytogenetickou charakterizaci nádorů mozku [online]. Brno, 2007, dostupné také z <https://is.muni.cz/th/ujhk6/Disertacni___prace.pdf?so=nx>. 

• ZDENĚK, Hájek, Čech EVŽEN a Maršál KAREL, et al. Porodnictví : 3., zcela přepracované a doplněné vydání. - vydání. Grada Publishing, a.s., 2014. 1599 s. ISBN 9788024745299.