Southernův blotting

Southernův blotting a jeho využití, odvozené metody

výkonným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem je gelová elektroforéza
molekuly DNA mají v podstatě stejný náboj na jednotku hmotnosti, takže se dělí na agarózových nebo polyakrylamidových gelech téměř výhradně na základě své velikosti nebo konformace
agarózové a polyakrylamidové gely působí jako molekulární síta, která zpomalují průchod velkých molekul více než malých
agarózové gely jsou vhodnější síta pro velké molekuly (nad několik set nukleotidů), zatímco polyakrylamidové gely jsou lepší pro rozdělování malých molekul DNA

v roce 1975 publikoval E. M. Southern důležitý nový pracovní postup, který umožnil zjistit umístění genů a jiných sekvencí v restrikčních fragmentech separovaných gelovou elektroforézou
základním rysem této metody je přenos molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu
takový přenos DNA je nazýván Southernův přenos
DNA je buď před, nebo během přenosu denaturována tím, že je gel umístněn do zásaditého roztoku
po přenosu je DNA imobilizována na membráně vysušením nebo ozářením UV světlem a hybridizována s radioaktivní DNA-sondou obsahující studovanou sekvenci
sonda bude hybridizovat pouze s molekulami DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci sondy
nehybridizované sondy jsou pak vymyty z povrchu membrány a takto upravená membrána je exponována na rentgenový film, aby mohla být detekována přítomnost radioaktivity
po vyvolání filmu ukazují tmavé proužky pozici sekvencí DNA, které se sondou hybridizovaly
schopnost přenosu molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nylonové membrány za účelem hybridizačních studií a jiných druhů analýz se ukázala jako neobyčejně užitečná
lze ji například využít při detekci genu cystické fibrózy atd.

Detekce RNA pomocí northernového blottingu

jedná se o přenos molekul RNA po jejich separaci elektroforézou
tento přenos se nazývá northernový přenos
jediný rozdíl od Southernova přenosu je, že se na membránu přenášejí molekuly RNA
metoda northernového přenosu je prakticky identická se Southernovým přenosem
molekuly RNA jsou však velmi citlivé na degradaci RNázami, a proto musí být zabráněno kontaminaci materiálu tímto extrémně stabilním enzymem
kromě toho, většina molekul RNA obsahuje sekundární strukturu a musí proto zůstat během elektroforézy denaturovaná, aby byla zajištěna separace na základě velikosti
denaturace dosáhneme přidáním formaldehydu nebo některého denaturačního činidla do pufru používaného při elektroforéze
po přenosu na membránu RNA hybridizuje buď s DNA, nebo RNA-sondami, stejně jako je to u Southernova přenosu
northernová hybridizace je nesmírně užitečná při studiích genové exprese
může se použít k určení, kdy a kde se jednotlivé geny exprimují
nicméně northernová hybridizace stanovuje pouze míru akumulace RNA-transkriptů a neposkytuje žádnou informaci o tom, proč k akumulaci došlo
změny akumulace transkriptů mohou být způsobeny změnami rychlosti transkripce nebo naopak rychlosti degradace transkriptů

Western blot analýza proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE

protože je mnoho funkčních proteinů složeno ze dvou nebo více podjednotek jsou jednotlivé polypeptidy separovány v přítomnosti detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS), který denaturuje proteiny
po proběhnutí elektroforézy se proteiny detekují barvením Coomassie modří nebo značením stříbrem
rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí protilátek
přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu
po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny umístní do roztoku obsahujícím protilátku k tomuto proteinu
následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím
přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou
tato sekundární protilátka obecně reaguje s imunoglobuliny
sekundární protilátka je spojena (konjugována) buď s radioaktivním izotopem nebo enzymem

Vybrané kapitoly z lékařské biologie II, Petr Goetz a kol., Karolinum,1.vydání, Praha, 2002