Uživatel:Tpmirchi/Biochemie

Postup

Většinu stanovujeme tak, že analyt + něco nám dá barevný komplex, jehož absorbanci stanovujeme. Koncentraci analytu získáme de facto trojčlenkou – koncentrace standardu (znáte)/absorbance standardu (změříte) = koncentrace analytu (neznáte)/absorbance standardu (změříte)

Nezapomeňte, že absorbance se vždy měří proti něčemu – blanku aka slepému vzorku :)

Stanovení koncentrace hemoglobinu v krvi

Oxidace hemoglobinu na methemoglobin:

HbFeII + [FeIII(CN)6]3- → HbFeIII + [FeII(CN)6]4-

Přeměna methemoglobinu na kyanmethemoglobin:

HbFeIII + CN- → HbFeIIICN

Oxidace dvojmocného železa v hemoglobinu hexakyanoželezitanem draselným na trojmocné železo. Vzniklý methemoglobin se s kyanidem draselným přemění na stálý kyanmethemoglobin s jediným širokým absorpčním maximem ve viditelné oblasti při 540 nm. Stanovení fotometricky.

Hodnocení

Referenční rozmezí pro dospělého muže je 130–180 g/l a pro ženu 120–160 g/l.

↑ Dehydratace

↓ Anemie

Stanovení koncentrace celkové bílkoviny v séru.

Stanovujeme biuretovou reakcí. V alkalickém prostředí v přítomnosti měďnatých solí vytváří bílkoviny komplexní sloučeniny Cu2+ s ionty peptidových vazeb - fialové zbarvení → fotometrické stanovení v oblasti 540–560 nm.

Hodnocení

Referenční rozmezí: Koncentrace celkové bílkoviny v séru (S-celková bílkovina): 65–85 g/l

↑ Dehydratace

↓ Selhání jater

Stanovení koncentrace triacylglycerolů v séru.

Několik po sobě jdoucích enzymových reakcí:

• Lipoproteinová lipáza katalyzuje hydrolýzu triacylglycerolů na glycerol a mastné kyseliny.

• Uvolněný glycerol se převádí působením glycerolkinázy v přítomnosti ATP na glycerol-3-fosfát, který je pomocí glycerol-3-fosfátoxidázy oxidován na dihydroxyacetonfosfát.

• Současně vzniklý peroxid vodíku je využíván v další reakci katalyzované peroxidázou k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu. Vzniká chinoniminové barvivo, jehož absorbance se odečítá.

Schéma reakce zde

Hodnocení

Koncentrace triacylglycerolů v séru (fS-triacylglyceroly): 0,45–1,7 mmol/l

↑ Životní styl

↓ Nebývá - malnutrice?

Stanovení koncentrace celkového cholesterolu v séru.

Několik enzymových reakcí:

• vlastnímu stanovení celkového cholesterolu předchází hydrolýza esterů cholesterolu na volný cholesterol a mastné kyseliny pomocí enzymu cholesterolesterázy (CE).
• Následuje oxidace neesterifikovaného cholesterolu na 4-cholesten-3-on za současného vzniku peroxidu vodíku v reakci katalyzované cholesteroloxidázou (CHOD).
• Poslední reakce využívá peroxidu vodíku k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu a fenolu v přítomnosti dalšího enzymu peroxidázy (POD). Vzniká barevný produkt, jehož absorbance je úměrná množství cholesterolu

Schema reakce zde

Hodnocení

Koncentrace celkového cholesterolu v séru (S-cholesterol celkový): 2,9–5,0 mmol/l ↑ Životní styl, diabetici, hypothyreoza - vysoký představuje riziko kardiovaskulárních onemocnění

↓ Malnutrice, hyperthyreóza

Stanovení koncentrace močoviny v séru.

Při nepřímém stanovení je močovina nejprve působením enzymu ureasy katalyticky rozštěpena na oxid uhličitý a amoniak, který ve vodném prostředí přechází na amonný ion. Množství vzniklého amoniaku je poté stanoveno reakcí podle Berthelota. Amonný ion s chlornanem sodným a fenolem nebo salicylanem za katalýzy nitroprussidu sodného vytváří barevný produkt. Doporučená rutinní metoda využívá pro stanovení amonných iontů vzniklých v ureasové reakci přeměnu α-ketoglutarátu na glutamát. Reakce je katalyzována glutamátdehydrogensou, která je spřažena s oxidací NADH na NAD+ (Warburgův optický test).

Schéma reakce zde.

Warburgův optický test zde.