Uživatel:Tpmirchi/Biochemie

Postup

Většinu stanovujeme tak, že analyt + něco nám dá barevný komplex, jehož absorbanci stanovujeme. Koncentraci analytu získáme de facto trojčlenkou – koncentrace standardu (znáte)/absorbance standardu (změříte) = koncentrace analytu (neznáte)/absorbance standardu (změříte)

Nezapomeňte, že absorbance se vždy měří proti něčemu – blanku aka slepému vzorku :)

Stanovení koncentrace hemoglobinu v krvi

Oxidace hemoglobinu na methemoglobin:

HbFeII + [FeIII(CN)6]3- → HbFeIII + [FeII(CN)6]4-

Přeměna methemoglobinu na kyanmethemoglobin:

HbFeIII + CN- → HbFeIIICN

Oxidace dvojmocného železa v hemoglobinu hexakyanoželezitanem draselným na trojmocné železo. Vzniklý methemoglobin se s kyanidem draselným přemění na stálý kyanmethemoglobin s jediným širokým absorpčním maximem ve viditelné oblasti při 540 nm. Stanovení fotometricky.

Hodnocení

Referenční rozmezí pro dospělého muže je 130–180 g/l a pro ženu 120–160 g/l.

↑ Dehydratace

↓ Anemie

Stanovení koncentrace celkové bílkoviny v séru.

Stanovujeme biuretovou reakcí. V alkalickém prostředí v přítomnosti měďnatých solí vytváří bílkoviny komplexní sloučeniny Cu2+ s ionty peptidových vazeb - fialové zbarvení → fotometrické stanovení v oblasti 540–560 nm.

Hodnocení

Referenční rozmezí: Koncentrace celkové bílkoviny v séru (S-celková bílkovina): 65–85 g/l

↑ Dehydratace

↓ Selhání jater

Stanovení koncentrace triacylglycerolů v séru.

Několik po sobě jdoucích enzymových reakcí:

• Lipoproteinová lipáza katalyzuje hydrolýzu triacylglycerolů na glycerol a mastné kyseliny.

• Uvolněný glycerol se převádí působením glycerolkinázy v přítomnosti ATP na glycerol-3-fosfát, který je pomocí glycerol-3-fosfátoxidázy oxidován na dihydroxyacetonfosfát.

• Současně vzniklý peroxid vodíku je využíván v další reakci katalyzované peroxidázou k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu. Vzniká chinoniminové barvivo, jehož absorbance se odečítá.

Schéma reakce zde

Hodnocení

Koncentrace triacylglycerolů v séru (fS-triacylglyceroly): 0,45–1,7 mmol/l

↑ Životní styl

↓ Nebývá - malnutrice?

Stanovení koncentrace celkového cholesterolu v séru.

Několik enzymových reakcí:

• vlastnímu stanovení celkového cholesterolu předchází hydrolýza esterů cholesterolu na volný cholesterol a mastné kyseliny pomocí enzymu cholesterolesterázy (CE).
• Následuje oxidace neesterifikovaného cholesterolu na 4-cholesten-3-on za současného vzniku peroxidu vodíku v reakci katalyzované cholesteroloxidázou (CHOD).
• Poslední reakce využívá peroxidu vodíku k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu a fenolu v přítomnosti dalšího enzymu peroxidázy (POD). Vzniká barevný produkt, jehož absorbance je úměrná množství cholesterolu

Schema reakce zde

Hodnocení

Koncentrace celkového cholesterolu v séru (S-cholesterol celkový): 2,9–5,0 mmol/l

↑ Životní styl, diabetici, hypothyreoza - vysoký představuje riziko kardiovaskulárních onemocnění

↓ Malnutrice, hyperthyreóza

Stanovení koncentrace močoviny v séru.

Při nepřímém stanovení je močovina nejprve působením enzymu ureasy katalyticky rozštěpena na oxid uhličitý a amoniak, který ve vodném prostředí přechází na amonný ion. Množství vzniklého amoniaku je poté stanoveno reakcí podle Berthelota. Amonný ion s chlornanem sodným a fenolem nebo salicylanem za katalýzy nitroprussidu sodného vytváří barevný produkt. Doporučená rutinní metoda využívá pro stanovení amonných iontů vzniklých v ureasové reakci přeměnu α-ketoglutarátu na glutamát. Reakce je katalyzována glutamátdehydrogensou, která je spřažena s oxidací NADH na NAD+ (Warburgův optický test).

Schéma reakce zde:

Reakce katalyzovaná ureázou:
Močovina + H2O + 2 H+ —→ 2 NH4+ + CO2

Reakce katalyzovaná glutamátdehydrogenázou:
2 NH4+ + 2-oxoglutarát + NADH + H+ —→ L-glutamát + NAD+ + H2O

Warburgův optický test zde.

Hodnocení

Sérová koncentrace (S-urea): 1,7–8,3 mmol/l

↑ hypoperfuze ledvin

↓ nízký příjem bílkovin

Stanovení koncentrace kyseliny močové v séru.

Nepřímé stanovení: enzym urikasa, který přeměňuje kyselinu močovou na allantoin, peroxid vodíku a oxid uhličitý. Vzniklý peroxid vstupuje do spřažené reakce, katalyzované peroxidasou, při ní oxidační kopulací 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu vznikne chinoniminové barvivo, jehož intenzita zbarvení je úměrná koncentraci kyseliny močové ve vzorku.

(Při stanovení ruší kyselina askorbová. Proto je askorbátoxidasa v reakční směsi.)

Schéma reakce zde na str. 7

Hodnocení

Koncentrace kyseliny močové v séru (fS-kyselina močová): ženy 120–340 μmol/l, muži 120–420 μmol/l

↑ vyšší příjem purinů ve stravě (maso, vnitřnosti, luštěniny), alkoholici, nižší odpad ledvinami

↓ nízký příjem purinů v potravě

Stanovení koncentrace glukózy v séru enzymaticky.

• enzym glukózaoxidáza katalyzuje oxidaci glukózy vzdušným kyslíkem za vzniku kyseliny glukonové, která přechází ve vnitřní ester glukonolakton. Jako vedlejší produkt glukózaoxidázové reakce vzniká peroxidu vodíku
• V reakci katalyzované peroxidázou reaguje vznikající peroxid vodíku s 4-aminoantipyrinem, který se oxiduje na reaktivní meziprodukt, a ten s další látkou kopuluje na stálé rozpustné barvivo jehož absorbance se měří.

Hodnocení

3,9–5,6 mmol/l nalačno a po jídle nižší než 10 mmol/l

↑ Diabetes

↓ 3 hodiny praktik chemie bez svačiny

Stanovení koncentrace vápníku v séru.

Spektrofotometrické měření barevných komplexů, které vznikají reakcí komplexotvorných látek s kalciem. Např. o-kresolftalexon v alkalickém prostředí s vápenatými ionty poskytuje fialově zbarvený komplex, jehož intenzita zbarvení je úměrná koncentraci vápenatých iontů. Používá se též arsenaso-III

Hodnocení

Sérové kalcium: 2,25–2,75 mmol/l

Vyšší nebo nižší hodnoty mohou být důsledkem dysproteinémie.

Stanovení koncentrace železa v séru.

Reakce železa s komplexotvornou látkou.

• Uvolnění Fe3+ z vazby na transferin pomocí kyselin, např. HCl
• Redukce Fe3+ na Fe2+ kyselinou askorbovou
• Reakce Fe2+ s komplexotvorným činidlem (ferrozin) obsahujícím reaktivní skupiny -N=C-C=N- za vzniku barevného komplexu

Hodnocení

muži: 9–29 μmol/l

ženy: 7–28 μmol/l

↑ hemochromatóza, hemolýza

↓ krevní ztráty, narušená absorpce

Stanovení katalytické koncentrace ALT v séru.

• Podobně jako v případě AST vyžaduje pracovní postup 5–15 minutovou preinkubaci séra v reakční směsi bez 2-oxoglutarátu. Reakce je startována 2-oxoglutarátem.
• ALT katalyzuje reakci alaninu na pyruvát.
• Přidáním NADH a laktátdehydrogenázy se pyruvát redukuje na laktát. Redukce je provázena úbytkem NADH, což se projeví poklesem absorbance při 334, 340 nebo 365nm. Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance.

Schéma reakce zde

Hodnocení

muži do 0,8 a ženy do 0,6 ukat/l (pamatujte si že pod 1)