Glykemie/stanovení

Stanovení koncentrace glukózy v krvi je vyšetřením, které poskytne základní informaci o sacharidovém metabolismu. Odebírá se kapilární nebo venózní krev a glukóza se stanovuje v plné krvi, plazmě nebo séru. Při stanovení glukózy v plné krvi jsou hodnoty o 10–15 % nižší (v závislosti na hematokritu), v arteriální krvi jsou o 10 % vyšší než ve venózní (arteriovenózní rozdíl). Pro zabránění glykolýzy se do odběrových nádobek přidává NaF (2,5 mg na 1 ml plné krve).

Vyšetření koncentrace glukózy v krvi má potřebnou informační hodnotu pouze tehdy, pokud je znám časový interval mezi odběrem krve a příjmem potravy.

Vyšetření glykemie se provádí:

• nalačno (krev se odebírá nejméně 8 hodin po příjmu potravy) – indikováno při vyhledávání diabetiků a určení diagnózy DM;
• náhodně naměřená glykemie (krev se odebírá bez udání časového vztahu k příjmu potravy) – provádí se při podezření na hypoglykemii nebo hyperglykemii;
• po jídle – postprandiální glykemie (1 hodinu po jídle obsahujícím sacharidy) – indikováno při kontrole účinnosti léčby DM;
• jako glykemický profil – glykemie se stanovuje několikrát denně, obvykle před hlavními jídly, někdy i po jídle a v noci.

Metody stanovení glykemie

Stanovení glykemie v laboratorních podmínkách

Ke stanovení koncentrace glukózy se používají různé metody. Rozšířené jsou metody enzymové. Glukózu můžeme stanovit pomocí každého enzymu, který ji metabolizuje.

Glukózaoxidázová reakce

Glukózaoxidázová a peroxidázová reakce

Doporučená rutinní metoda využívá spřažených enzymových reakcí glukózaoxidázy (GOD, EC 1.1.3.4) a peroxidázy (POD, EC 1.11.1.7). V první reakci enzym glukózaoxidáza katalyzuje oxidaci glukózy vzdušným kyslíkem za vzniku kyseliny glukonové, která přechází ve vnitřní ester glukonolakton. Je známo, že v roztoku je 36 % glukózy ve formě α-anomeru a 64 % ve formě β-anomeru. GOD je vysoce specifická pro β-D-glukopyranosu. Aby se mohly oxidovat oba anomery, je nutná mutarotace α- na β-anomer, ke které dojde spontánně v průběhu dostatečně dlouhé inkubace. Jako vedlejší produkt glukózaoxidázové reakce se vytváří ekvimolární množství peroxidu vodíku.

V další reakci katalyzované peroxidázou reaguje vznikající peroxid vodíku s vhodným chromogenem, který se oxiduje na reaktivní meziprodukt, a ten s další látkou kopuluje na stálé rozpustné barvivo. Příkladem může být oxidační kopulace derivátu fenolu se 4-aminoantipyrinem na červené barvivo, jehož absorbance se po ustálení reakční rovnováhy měří.

Jiné metody využívají měření úbytku kyslíku, ke kterému dochází v průběhu reakce katalyzované glukózaoxidázou a který můžeme sledovat elektrochemicky kyslíkovou elektrodou nebo enzymovou elektrodou.

Hexokinázová reakce

Vysokou specifitou se vyznačuje metoda hexokinázová. Hexokináza (EC 2.7.1.1) fosforyluje glukózu v přítomnosti ATP na glukóza-6-fosfát. V dalším kroku se glukóza-6-fosfát oxiduje pomocí glukóza-6-fosfátdehydrogenázy proti NADP⁺ na 6-fosfoglukonolakton. Redukci NADP⁺ na NADPH lze vyhodnocovat přímou fotometrií v UV oblasti na principu Warburgova optického testu.

Stanovení glykemie v mimolaboratorních podmínkách

Glykemie patří mezi parametry, které se často vyšetřují i bez laboratorního zázemí. Rychlé orientační stanovení glykemie je běžné v urgentní péči. U pacientů léčených inzulínem se také s výhodou pravidelně sleduje glykemie pomocí osobního glukometru a na základě naměřených hodnot se upravuje léčba. Koncentrace glukózy v krvi patří mezi parametry nejčastěji stanovované technikami vyšetření v místě péče o pacienta (point of care testing, POCT). Nutno ovšem mít na paměti, že metody POCT, jakkoli zlepšují kvalitu péče i komfort nemocného, nenahrazují pravidelné lékařské vyšetření ani laboratorní kontroly.

Metody rychlého stanovení glykemie využívají několika principů. Výchozím materiálem je obvykle kapka plné kapilární krve, která se aplikuje na testovací proužek.

Nejstarší, ale dosud užívané proužky, jsou založeny na stejných reakcích jako fotometrické měření koncentrace glukózy. Kapilární krev vzlíná několika vrstvami z různých materiálů, díky čemuž se oddělí krvinky a do reakční zóny proniká jen plazma. Reakční zóna obsahuje glukózaoxidázu, peroxidázu a vhodný chromogen. V závislosti na koncentraci glukózy se vyvíjí různě intenzivní zbarvení. Vyhodnocení se provádí buď vizuálně srovnáním s barevnou stupnicí nebo pomocí glukometru – jednoúčelového reflexního fotometru. Výhodou vizuálního hodnocení je jeho nezávislost na jakémkoli přístrojovém vybavení. Stanovení glykemie tímto přístupem je sice jen přibližné, zejména v urgentní péči v terénu však zcela postačující. Glukometry založené na reflexní fotometrii jsou v současnosti vytlačovány spolehlivějšími elektrochemickými analyzátory.

Většina glukometrů dnes využívá enzymové elektrody .

Senzory první generace se objevily již v šedesátých letech 20. století. Nejstarší systém byl založen na glukózaoxidázové reakci. Využíval dvou elektrod, jedna byla pokrytá enzymem. Koncentrace kyslíku ve vzorku a rychlost jejího poklesu v průběhu reakce se měřila tzv. Clarkovou metodou: kyslík se redukuje na platinové katodě, intenzita proudu mezi katodou a anodou odpovídá jeho koncentraci:

<chemform>O2</chemform> + 4 <chemform>H+</chemform> + 4 <chemform>e-</chemform> → 2 <chemform>H2O</chemform>

Později se namísto spotřeby kyslíku stanovovala elektrochemicky produkce peroxidu vodíku. I v tomto případě jde o jednoduchou elektrochemickou reakci, tentokrát probíhající na anodě:

<chemform>H2O2</chemform> → <chemform>O2</chemform> + 2 <chemform>H+</chemform> + 2 <chemform>e-</chemform>

Takto konstruované analyzátory byly jednodušší a bylo možné je více miniaturizovat. Ampérometrické měření podukce peroxidu vodíku je ovšem ovlivněno řadou látek: askorbátem, kyselinou močovou, mnohými léčivy apod. Jiným problémem mnohých senzorů první generace byla závislost výsledků měření na nasycení vzorku kyslíkem.

Senzory druhé generace jsou rovněž založeny na glukózaoxidázové reakci, namísto molekulárního kyslíku je však akceptorem elektronů jiná látka – tzv. mediátor. Jinou možností je oxidace glukózy na glukonolakton jiným bakteriálním enzymem, glukózadehydrogenázou, přičemž elektrony se opět přenášejí na vhodný mediátor. Redukovaný mediátor se v obou případech znovu oxiduje na anodě a měří se buď proud protékající mezi katodou a anodou (ampérometrické stanovení), nebo výsledný náboj anody (coulumbometrické stanovení). Používá se řada konkrétních uspořádání testovacích proužků, jako mediátory se využívají různé látky (např. kyanoželezitan, hexamin ruthenia, komplexy osmia, fenantrolinchinon).