Southernův blotting: Porovnání verzí
Z WikiSkript
m (Robot: Removing image Immunoblot.png) |
m (typo) |
||
| Řádek 9: | Řádek 9: | ||
* základním rysem této metody je přenos molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu | * základním rysem této metody je přenos molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu | ||
* takový přenos DNA je nazýván Southernův přenos | * takový přenos DNA je nazýván Southernův přenos | ||
* DNA je buď před, nebo během přenosu [[Denaturace nukleových kyselin, molekulární hybridizace|denaturována]] tím, že je gel | * DNA je buď před, nebo během přenosu [[Denaturace nukleových kyselin, molekulární hybridizace|denaturována]] tím, že je gel umístěn do zásaditého roztoku | ||
* po přenosu je DNA imobilizována na membráně vysušením nebo ozářením [[Ultrafialové záření (biofyzika)|UV]] světlem a hybridizována s radioaktivní DNA-sondou obsahující studovanou sekvenci | * po přenosu je DNA imobilizována na membráně vysušením nebo ozářením [[Ultrafialové záření (biofyzika)|UV]] světlem a hybridizována s radioaktivní DNA-sondou obsahující studovanou sekvenci | ||
* sonda bude hybridizovat pouze s molekulami DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci sondy | * sonda bude hybridizovat pouze s molekulami DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci sondy | ||
| Řádek 40: | Řádek 40: | ||
* rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí [[Protilátka|protilátek]] | * rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí [[Protilátka|protilátek]] | ||
* přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu | * přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu | ||
* po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny | * po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny umístí do roztoku obsahujícím protilátku k tomuto proteinu | ||
* následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím | * následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím | ||
* přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou | * přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou | ||
Verze z 1. 12. 2017, 20:19
Southernův blotting a jeho využití, odvozené metody
- výkonným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem je gelová elektroforéza
- molekuly DNA mají v podstatě stejný náboj na jednotku hmotnosti, takže se dělí na agarózových nebo polyakrylamidových gelech téměř výhradně na základě své velikosti nebo konformace
- agarózové a polyakrylamidové gely působí jako molekulární síta, která zpomalují průchod velkých molekul více než malých
- agarózové gely jsou vhodnější síta pro velké molekuly (nad několik set nukleotidů), zatímco polyakrylamidové gely jsou lepší pro rozdělování malých molekul DNA
Analýza DNA pomocí Southernova blottingu
- v roce 1975 publikoval E. M. Southern důležitý nový pracovní postup, který umožnil zjistit umístění genů a jiných sekvencí v restrikčních fragmentech separovaných gelovou elektroforézou
- základním rysem této metody je přenos molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu
- takový přenos DNA je nazýván Southernův přenos
- DNA je buď před, nebo během přenosu denaturována tím, že je gel umístěn do zásaditého roztoku
- po přenosu je DNA imobilizována na membráně vysušením nebo ozářením UV světlem a hybridizována s radioaktivní DNA-sondou obsahující studovanou sekvenci
- sonda bude hybridizovat pouze s molekulami DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci sondy
- nehybridizované sondy jsou pak vymyty z povrchu membrány a takto upravená membrána je exponována na rentgenový film, aby mohla být detekována přítomnost radioaktivity
- po vyvolání filmu ukazují tmavé proužky pozici sekvencí DNA, které se sondou hybridizovaly
- schopnost přenosu molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nylonové membrány za účelem hybridizačních studií a jiných druhů analýz se ukázala jako neobyčejně užitečná
- lze ji například využít při detekci genu cystické fibrózy atd.
Analýza RNA pomocí northernového blottingu
- jedná se o přenos molekul RNA po jejich separaci elektroforézou
- tento přenos se nazývá northernový přenos
- jediný rozdíl od Southernova přenosu je, že se na membránu přenášejí molekuly RNA
- metoda northernového přenosu je prakticky identická se Southernovým přenosem
- molekuly RNA jsou však velmi citlivé na degradaci RNázami, a proto musí být zabráněno kontaminaci materiálu tímto extrémně stabilním enzymem
- kromě toho, většina molekul RNA obsahuje sekundární strukturu a musí proto zůstat během elektroforézy denaturovaná, aby byla zajištěna separace na základě velikosti
- denaturace dosáhneme přidáním formaldehydu nebo některého denaturačního činidla do pufru používaného při elektroforéze
- po přenosu na membránu RNA hybridizuje buď s DNA, nebo RNA-sondami, stejně jako je to u Southernova přenosu
- northernová hybridizace je nesmírně užitečná při studiích genové exprese
- může se použít k určení, kdy a kde se jednotlivé geny exprimují
- nicméně northernová hybridizace stanovuje pouze míru akumulace RNA-transkriptů a neposkytuje žádnou informaci o tom, proč k akumulaci došlo
- změny akumulace transkriptů mohou být způsobeny změnami rychlosti transkripce nebo naopak rychlosti degradace transkriptů
Analýza proteinů westernovým přenosem
- někdy označován také jako imunoblot
- protože je mnoho funkčních proteinů složeno ze dvou nebo více podjednotek, jsou jednotlivé polypeptidy separovány v přítomnosti detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS), který denaturuje proteiny
- po proběhnutí elektroforézy se proteiny detekují barvením Coomassie modří nebo značením stříbrem
- rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí protilátek
- přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu
- po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny umístí do roztoku obsahujícím protilátku k tomuto proteinu
- následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím
- přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou
- tato sekundární protilátka obecně reaguje s imunoglobuliny
- sekundární protilátka je spojena (konjugována) buď s radioaktivním izotopem nebo enzymem
Odkazy
Související články
Použitá literatura
- MURRAY, Robert K, et al. Harperova biochemie. 2. české (v H & H 1.) vydání. Praha : H & H, 1998. 872 s. ISBN 80-85787-38-5.
- GOETZ, Pavel, et al. Vybrané kapitoly z lékařské biologie II. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2002. 139 s. ISBN 80-246-0320-9.
