Southernův blotting: Porovnání verzí
Z WikiSkript
m (Nahrazení textu „ ]]“ textem „]]“) |
m (Robot: kosmetické úpravy) |
||
| Řádek 1: | Řádek 1: | ||
== Southernův blotting a jeho využití, odvozené metody == | == Southernův blotting a jeho využití, odvozené metody == | ||
*výkonným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem je gelová [[Elektroforéza nukleových kyselin|elektroforéza]] | * výkonným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem je gelová [[Elektroforéza nukleových kyselin|elektroforéza]] | ||
*molekuly [[DNA (nukleová kyselina)|DNA]] mají v podstatě stejný náboj na jednotku hmotnosti, takže se dělí na agarózových nebo polyakrylamidových gelech téměř výhradně na základě své velikosti nebo [[ | * molekuly [[DNA (nukleová kyselina)|DNA]] mají v podstatě stejný náboj na jednotku hmotnosti, takže se dělí na agarózových nebo polyakrylamidových gelech téměř výhradně na základě své velikosti nebo [[konformace]] | ||
*agarózové a polyakrylamidové gely působí jako molekulární síta, která zpomalují průchod velkých molekul více než malých | * agarózové a polyakrylamidové gely působí jako molekulární síta, která zpomalují průchod velkých molekul více než malých | ||
*agarózové gely jsou vhodnější síta pro velké molekuly (nad několik set [[nukleotid]]ů), zatímco polyakrylamidové gely jsou lepší pro rozdělování malých molekul DNA | * agarózové gely jsou vhodnější síta pro velké molekuly (nad několik set [[nukleotid]]ů), zatímco polyakrylamidové gely jsou lepší pro rozdělování malých molekul DNA | ||
=== Analýza DNA pomocí Southernova blottingu === | === Analýza DNA pomocí Southernova blottingu === | ||
*v roce 1975 publikoval E. M. Southern důležitý nový pracovní postup, který umožnil zjistit umístění [[gen]]ů a jiných sekvencí v restrikčních fragmentech separovaných gelovou elektroforézou | * v roce 1975 publikoval E. M. Southern důležitý nový pracovní postup, který umožnil zjistit umístění [[gen]]ů a jiných sekvencí v restrikčních fragmentech separovaných gelovou elektroforézou | ||
*základním rysem této metody je přenos molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu | * základním rysem této metody je přenos molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu | ||
*takový přenos DNA je nazýván Southernův přenos | * takový přenos DNA je nazýván Southernův přenos | ||
*DNA je buď před, nebo během přenosu [[Denaturace nukleových kyselin, molekulární hybridizace|denaturována]] tím, že je gel umístněn do zásaditého roztoku | * DNA je buď před, nebo během přenosu [[Denaturace nukleových kyselin, molekulární hybridizace|denaturována]] tím, že je gel umístněn do zásaditého roztoku | ||
*po přenosu je DNA imobilizována na membráně vysušením nebo ozářením [[Ultrafialové záření (biofyzika)|UV]] světlem a hybridizována s radioaktivní DNA-sondou obsahující studovanou sekvenci | * po přenosu je DNA imobilizována na membráně vysušením nebo ozářením [[Ultrafialové záření (biofyzika)|UV]] světlem a hybridizována s radioaktivní DNA-sondou obsahující studovanou sekvenci | ||
*sonda bude hybridizovat pouze s molekulami DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci sondy | * sonda bude hybridizovat pouze s molekulami DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci sondy | ||
*nehybridizované sondy jsou pak vymyty z povrchu membrány a takto upravená membrána je exponována na [[Rentgen| | * nehybridizované sondy jsou pak vymyty z povrchu membrány a takto upravená membrána je exponována na [[Rentgen|rentgenový]] film, aby mohla být detekována přítomnost [[radioaktivita|radioaktivity]] | ||
*po vyvolání filmu ukazují tmavé proužky pozici sekvencí DNA, které se sondou hybridizovaly | * po vyvolání filmu ukazují tmavé proužky pozici sekvencí DNA, které se sondou hybridizovaly | ||
*schopnost přenosu molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nylonové membrány za účelem hybridizačních studií a jiných druhů analýz se ukázala jako neobyčejně užitečná | * schopnost přenosu molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nylonové membrány za účelem hybridizačních studií a jiných druhů analýz se ukázala jako neobyčejně užitečná | ||
*lze ji například využít při detekci genu [[Cystická fibróza|cystické fibrózy]] atd. | * lze ji například využít při detekci genu [[Cystická fibróza|cystické fibrózy]] atd. | ||
=== Analýza RNA pomocí northernového blottingu === | === Analýza RNA pomocí northernového blottingu === | ||
[[Soubor: Northern_Blot_Scheme.PNG | thumb | Detekce RNA pomocí northernového blottingu]] | [[Soubor: Northern_Blot_Scheme.PNG | thumb | Detekce RNA pomocí northernového blottingu]] | ||
*jedná se o přenos molekul [[RNA]] po jejich separaci elektroforézou | * jedná se o přenos molekul [[RNA]] po jejich separaci elektroforézou | ||
*tento přenos se nazývá northernový přenos | * tento přenos se nazývá northernový přenos | ||
*jediný rozdíl od Southernova přenosu je, že se na membránu přenášejí molekuly RNA | * jediný rozdíl od Southernova přenosu je, že se na membránu přenášejí molekuly RNA | ||
*metoda northernového přenosu je prakticky identická se Southernovým přenosem | * metoda northernového přenosu je prakticky identická se Southernovým přenosem | ||
*molekuly RNA jsou však velmi citlivé na degradaci RNázami, a proto musí být zabráněno kontaminaci materiálu tímto extrémně stabilním [[Enzymy| | * molekuly RNA jsou však velmi citlivé na degradaci RNázami, a proto musí být zabráněno kontaminaci materiálu tímto extrémně stabilním [[Enzymy|enzymem]] | ||
*kromě toho, většina molekul RNA obsahuje sekundární strukturu a musí proto zůstat během elektroforézy denaturovaná, aby byla zajištěna separace na základě velikosti | * kromě toho, většina molekul RNA obsahuje sekundární strukturu a musí proto zůstat během elektroforézy denaturovaná, aby byla zajištěna separace na základě velikosti | ||
*denaturace dosáhneme přidáním formaldehydu nebo některého denaturačního činidla do [[pufr]]u používaného při elektroforéze | * denaturace dosáhneme přidáním formaldehydu nebo některého denaturačního činidla do [[pufr]]u používaného při elektroforéze | ||
*po přenosu na membránu RNA hybridizuje buď s DNA, nebo RNA-sondami, stejně jako je to u Southernova přenosu | * po přenosu na membránu RNA hybridizuje buď s DNA, nebo RNA-sondami, stejně jako je to u Southernova přenosu | ||
*northernová hybridizace je nesmírně užitečná při studiích [[Genová exprese|genové exprese]] | * northernová hybridizace je nesmírně užitečná při studiích [[Genová exprese|genové exprese]] | ||
*může se použít k určení, kdy a kde se jednotlivé geny exprimují | * může se použít k určení, kdy a kde se jednotlivé geny exprimují | ||
*nicméně northernová hybridizace stanovuje pouze míru akumulace RNA-transkriptů a neposkytuje žádnou informaci o tom, proč k akumulaci došlo | * nicméně northernová hybridizace stanovuje pouze míru akumulace RNA-transkriptů a neposkytuje žádnou informaci o tom, proč k akumulaci došlo | ||
*změny akumulace transkriptů mohou být způsobeny změnami rychlosti [[transkripce]] nebo naopak rychlosti degradace transkriptů | * změny akumulace transkriptů mohou být způsobeny změnami rychlosti [[transkripce]] nebo naopak rychlosti degradace transkriptů | ||
=== Analýza proteinů westernovým přenosem === | === Analýza proteinů westernovým přenosem === | ||
[[Soubor: Immunoblot.png| thumb | Western blot analýza proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE]] | [[Soubor: Immunoblot.png| thumb | Western blot analýza proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE]] | ||
*někdy označován také jako ''imunoblot'' | * někdy označován také jako ''imunoblot'' | ||
*protože je mnoho funkčních [[Protein| | * protože je mnoho funkčních [[Protein|proteinů]] složeno ze dvou nebo více podjednotek, jsou jednotlivé polypeptidy separovány v přítomnosti detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS), který denaturuje proteiny | ||
*po proběhnutí elektroforézy se proteiny detekují barvením Coomassie modří nebo značením stříbrem | * po proběhnutí elektroforézy se proteiny detekují barvením Coomassie modří nebo značením stříbrem | ||
*rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí [[Protilátka|protilátek]] | * rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí [[Protilátka|protilátek]] | ||
*přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu | * přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu | ||
*po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny umístní do roztoku obsahujícím protilátku k tomuto proteinu | * po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny umístní do roztoku obsahujícím protilátku k tomuto proteinu | ||
*následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím | * následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím | ||
*přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou | * přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou | ||
*tato sekundární protilátka obecně reaguje s imunoglobuliny | * tato sekundární protilátka obecně reaguje s imunoglobuliny | ||
*sekundární protilátka je spojena (konjugována) buď s radioaktivním [[izotop]]em nebo enzymem | * sekundární protilátka je spojena (konjugována) buď s radioaktivním [[izotop]]em nebo enzymem | ||
<noinclude> | <noinclude> | ||
== Odkazy == | == Odkazy == | ||
=== Související články === | === Související články === | ||
*[[Metody analýzy nukleových kyselin]] | * [[Metody analýzy nukleových kyselin]] | ||
=== Použitá literatura === | === Použitá literatura === | ||
*{{Citace | * {{Citace | ||
| typ = kniha | | typ = kniha | ||
| příjmení1 = Murray | | příjmení1 = Murray | ||
| Řádek 64: | Řádek 64: | ||
| isbn = 80-85787-38-5 | | isbn = 80-85787-38-5 | ||
}} | }} | ||
*{{Citace | * {{Citace | ||
| typ = kniha | | typ = kniha | ||
| příjmení1 = Goetz | | příjmení1 = Goetz | ||
Verze z 29. 11. 2014, 23:01
Southernův blotting a jeho využití, odvozené metody
- výkonným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem je gelová elektroforéza
- molekuly DNA mají v podstatě stejný náboj na jednotku hmotnosti, takže se dělí na agarózových nebo polyakrylamidových gelech téměř výhradně na základě své velikosti nebo konformace
- agarózové a polyakrylamidové gely působí jako molekulární síta, která zpomalují průchod velkých molekul více než malých
- agarózové gely jsou vhodnější síta pro velké molekuly (nad několik set nukleotidů), zatímco polyakrylamidové gely jsou lepší pro rozdělování malých molekul DNA
Analýza DNA pomocí Southernova blottingu
- v roce 1975 publikoval E. M. Southern důležitý nový pracovní postup, který umožnil zjistit umístění genů a jiných sekvencí v restrikčních fragmentech separovaných gelovou elektroforézou
- základním rysem této metody je přenos molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu
- takový přenos DNA je nazýván Southernův přenos
- DNA je buď před, nebo během přenosu denaturována tím, že je gel umístněn do zásaditého roztoku
- po přenosu je DNA imobilizována na membráně vysušením nebo ozářením UV světlem a hybridizována s radioaktivní DNA-sondou obsahující studovanou sekvenci
- sonda bude hybridizovat pouze s molekulami DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci sondy
- nehybridizované sondy jsou pak vymyty z povrchu membrány a takto upravená membrána je exponována na rentgenový film, aby mohla být detekována přítomnost radioaktivity
- po vyvolání filmu ukazují tmavé proužky pozici sekvencí DNA, které se sondou hybridizovaly
- schopnost přenosu molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nylonové membrány za účelem hybridizačních studií a jiných druhů analýz se ukázala jako neobyčejně užitečná
- lze ji například využít při detekci genu cystické fibrózy atd.
Analýza RNA pomocí northernového blottingu
- jedná se o přenos molekul RNA po jejich separaci elektroforézou
- tento přenos se nazývá northernový přenos
- jediný rozdíl od Southernova přenosu je, že se na membránu přenášejí molekuly RNA
- metoda northernového přenosu je prakticky identická se Southernovým přenosem
- molekuly RNA jsou však velmi citlivé na degradaci RNázami, a proto musí být zabráněno kontaminaci materiálu tímto extrémně stabilním enzymem
- kromě toho, většina molekul RNA obsahuje sekundární strukturu a musí proto zůstat během elektroforézy denaturovaná, aby byla zajištěna separace na základě velikosti
- denaturace dosáhneme přidáním formaldehydu nebo některého denaturačního činidla do pufru používaného při elektroforéze
- po přenosu na membránu RNA hybridizuje buď s DNA, nebo RNA-sondami, stejně jako je to u Southernova přenosu
- northernová hybridizace je nesmírně užitečná při studiích genové exprese
- může se použít k určení, kdy a kde se jednotlivé geny exprimují
- nicméně northernová hybridizace stanovuje pouze míru akumulace RNA-transkriptů a neposkytuje žádnou informaci o tom, proč k akumulaci došlo
- změny akumulace transkriptů mohou být způsobeny změnami rychlosti transkripce nebo naopak rychlosti degradace transkriptů
Analýza proteinů westernovým přenosem
Soubor:Immunoblot.png
Western blot analýza proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE
- někdy označován také jako imunoblot
- protože je mnoho funkčních proteinů složeno ze dvou nebo více podjednotek, jsou jednotlivé polypeptidy separovány v přítomnosti detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS), který denaturuje proteiny
- po proběhnutí elektroforézy se proteiny detekují barvením Coomassie modří nebo značením stříbrem
- rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí protilátek
- přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu
- po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny umístní do roztoku obsahujícím protilátku k tomuto proteinu
- následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím
- přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou
- tato sekundární protilátka obecně reaguje s imunoglobuliny
- sekundární protilátka je spojena (konjugována) buď s radioaktivním izotopem nebo enzymem
Odkazy
Související články
Použitá literatura
- MURRAY, Robert K, et al. Harperova biochemie. 2. české (v H & H 1.) vydání. Praha : H & H, 1998. 872 s. ISBN 80-85787-38-5.
- GOETZ, Pavel, et al. Vybrané kapitoly z lékařské biologie II. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2002. 139 s. ISBN 80-246-0320-9.
