Southernův blotting

Southernův blotting a jeho využití, odvozené metody

• výkonným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem je gelová elektroforéza
• molekuly DNA mají v podstatě stejný náboj na jednotku hmotnosti, takže se dělí na agarózových nebo polyakrylamidových gelech téměř výhradně na základě své velikosti nebo konformace
• agarózové a polyakrylamidové gely působí jako molekulární síta, která zpomalují průchod velkých molekul více než malých
• agarózové gely jsou vhodnější síta pro velké molekuly (nad několik set nukleotidů), zatímco polyakrylamidové gely jsou lepší pro rozdělování malých molekul DNA

Analýza DNA pomocí Southernova blottingu

• v roce 1975 publikoval E. M. Southern důležitý nový pracovní postup, který umožnil zjistit umístění genů a jiných sekvencí v restrikčních fragmentech separovaných gelovou elektroforézou
• základním rysem této metody je přenos molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu
• takový přenos DNA je nazýván Southernův přenos
• DNA je buď před, nebo během přenosu denaturována tím, že je gel umístněn do zásaditého roztoku
• po přenosu je DNA imobilizována na membráně vysušením nebo ozářením UV světlem a hybridizována s radioaktivní DNA-sondou obsahující studovanou sekvenci
• sonda bude hybridizovat pouze s molekulami DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci sondy
• nehybridizované sondy jsou pak vymyty z povrchu membrány a takto upravená membrána je exponována na rentgenový film, aby mohla být detekována přítomnost radioaktivity
• po vyvolání filmu ukazují tmavé proužky pozici sekvencí DNA, které se sondou hybridizovaly
• schopnost přenosu molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nylonové membrány za účelem hybridizačních studií a jiných druhů analýz se ukázala jako neobyčejně užitečná
• lze ji například využít při detekci genu cystické fibrózy atd.

Analýza RNA pomocí northernového blottingu

Detekce RNA pomocí northernového blottingu

• jedná se o přenos molekul RNA po jejich separaci elektroforézou
• tento přenos se nazývá northernový přenos
• jediný rozdíl od Southernova přenosu je, že se na membránu přenášejí molekuly RNA
• metoda northernového přenosu je prakticky identická se Southernovým přenosem
• molekuly RNA jsou však velmi citlivé na degradaci RNázami, a proto musí být zabráněno kontaminaci materiálu tímto extrémně stabilním enzymem
• kromě toho, většina molekul RNA obsahuje sekundární strukturu a musí proto zůstat během elektroforézy denaturovaná, aby byla zajištěna separace na základě velikosti
• denaturace dosáhneme přidáním formaldehydu nebo některého denaturačního činidla do pufru používaného při elektroforéze
• po přenosu na membránu RNA hybridizuje buď s DNA, nebo RNA-sondami, stejně jako je to u Southernova přenosu
• northernová hybridizace je nesmírně užitečná při studiích genové exprese
• může se použít k určení, kdy a kde se jednotlivé geny exprimují
• nicméně northernová hybridizace stanovuje pouze míru akumulace RNA-transkriptů a neposkytuje žádnou informaci o tom, proč k akumulaci došlo
• změny akumulace transkriptů mohou být způsobeny změnami rychlosti transkripce nebo naopak rychlosti degradace transkriptů

Analýza proteinů westernovým přenosem

Soubor:Immunoblot.png

Western blot analýza proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE

• někdy označován také jako imunoblot
• protože je mnoho funkčních proteinů složeno ze dvou nebo více podjednotek, jsou jednotlivé polypeptidy separovány v přítomnosti detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS), který denaturuje proteiny
• po proběhnutí elektroforézy se proteiny detekují barvením Coomassie modří nebo značením stříbrem
• rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí protilátek
• přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu
• po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny umístní do roztoku obsahujícím protilátku k tomuto proteinu
• následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím
• přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou
• tato sekundární protilátka obecně reaguje s imunoglobuliny
• sekundární protilátka je spojena (konjugována) buď s radioaktivním izotopem nebo enzymem

Odkazy

Související články

• Metody analýzy nukleových kyselin

Použitá literatura

• MURRAY, Robert K, et al. Harperova biochemie. 2. české (v H & H 1.) vydání. Praha : H & H, 1998. 872 s. ISBN 80-85787-38-5.

• GOETZ, Pavel, et al. Vybrané kapitoly z lékařské biologie II. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2002. 139 s. ISBN 80-246-0320-9.