Zobrazení zdroje stránky Denaturace nukleových kyselin, molekulární hybridizace

[[Soubor:Denaturace_NK.png|thumb|300px|Denaturace nukleových kyselin]]

Vodíkové můstky ve [[DNA (nukleová kyselina)|dvouřetězcové DNA]] (double strand DNA, '''dsDNA'''), lze zrušit extrémním [[pH]], močovinou nebo teplem. Následné oddělení řetězců, tj. '''denaturaci DNA''', je možné sledovat pomocí tzv. '''hyperchromního efektu'''. Vlivem interakce elektronů v párovaných bazích roztoky dsDNA absorbují [[Ultrafialové záření (biofyzika)|UV]] světlo (při 260 nm) méně, než stejná koncentrace bazí v mononukleotidech nebo v jednořetězcové DNA (single strand DNA, '''ssDNA'''). Zahřívá–li se roztok dsDNA, pak při určité teplotě absorbance náhle stoupne. Teplota, při které je první derivace křivky nejvyšší, se nazývá '''bod tání DNA''' (melting point, '''T<sub>m</sub>'''). Čím více párů G&equiv;C zkoumaná dsDNA obsahuje, tím vyšší je T<sub>m</sub>. Tři vodíkové můstky v G&equiv;C vyžadují více tepelné energie než dva v A=T.

'''Denaturace DNA''' je '''reverzibilní'''. Komplementární ssDNA se např. při poklesu teploty nebo snížení koncentrace močoviny mohou opět spojit v dsDNA. Rozplétání a splétání dvoušroubovice je ''[[in vivo]]'' běžným jevem (např. při biosyntéze nukleových kyselin). Spojování dvou komplementárních řetězců nukleových kyselin ''[[in vitro]]'' do dvoušroubovic se nazývá '''reasociace'''. Pokud reasociují různé typy nukleových kyselin (DNA s RNA), jde o '''molekulární hybridizaci'''. Metodicky se těchto jevů využívá k oddělení určité ssDNA nebo ssRNA ze směsi, k mapování [[genom]]u a ke zjištění poruch struktury [[gen]]u (diagnostika genetických vad).

'''Technické uspořádání''' reasociace nukleových kyselin je různé. Nejdříve se např. na membránový filtr nebo na sacharidový gel v koloně naváže ssDNA o známé sekvenci, komplementární k nukleové kyselině hledané ve směsi. Při průtoku zkoumané směsi nukleových kyselin takto upraveným filtrem či kolonou se hledaná komplementární ssDNA nebo ssRNA asociuje s DNA fixovanou k nosiči. Po promytí lze zachycenou nukleovou kyselinu uvolnit (eluovat) vhodným činidlem rušícím vodíkové můstky.

Pro''' diagnostické účely''' se DNA pacienta (z lymfocytů, amniových buněk apod.) v definovaných místech nejdříve rozštěpí některou z restrikčních endonukleáz. Směs fragmentů se rozdělí [[Elektroforéza nukleových kyselin|gelovou elektroforézou]]. Pak se zjistí, zda–li některý z fragmentů DNA obsahuje určitou sekvenci nukleotidů, kritickou pro danou nemoc. Postupuje se tak, že fragmenty DNA se z gelového elektroforeogramu přenesou na materiál vhodnější k hybridizaci, tj. nitrocelulózový filtr. Tento filtr je třeba položit na suchý filtrační papír, na filtr přitisknout elektroforeogram a na tento gel přiložit filtrační papír navlhčený v koncentrovaném roztoku soli.

[[Soubor:Uspořádání_blottingu.png|thumb|450px|Uspořádání blottingu]]

Elektroforetické frakce (fragmenty DNA) se „přepijákují“ ('''blotting''') na nitrocelulózový filtr a denaturují se. Tím se vytvoří vhodné technické podmínky pro reasociaci komplementárních řetězců. Filtr se přelije roztokem radioaktivně značené a krátké umělé nukleové kyseliny, která obsahuje hledanou sekvenci. Tato tzv. '''próba''' se asociuje pouze s restrikčním fragmentem DNA obsahujícím komplementární sekvenci, což po opláchnutí filtru ukáže přiložená fotografická fólie ('''autoradiografie''').

Popsanou metodu analýzy restrikčních fragmentů DNA vypracoval Eduard M. Southern. Nese jeho jméno ('''Southern blotting''') a je velmi rozšířena. Jestliže se zcela analogickým způsobem hledá komplemetární sekvence ve směsi blotovaných [[mRNA]], mluví se o tzv. '''Northern blottingu'''. Jméno pana Southerna (česky pana Jižního) se stalo obětí nomenklaturního vtipu (northern = severní). Imunochemici v této legraci pokračovali: při '''western blottingu''' (western = západní) se jedná o analogickou techniku, kde však interaguje antigen s protilátkou. V každém případě blotting představuje elegantní, rychlou a rutinně zvládnutelnou metodu.
<noinclude>

== Odkazy ==
=== Související články ===
* [[Struktura nukleových kyselin]]
* [[Základní složky nukleových kyselin]]
* [[Primární struktura nukleových kyselin]]
* [[Štěpení nukleové kyseliny hydrolýzou]]
* [[Metody sekvencování]]
* [[Sekundární struktura DNA]]
* [[Sekundární struktura RNA]]
* [[Topologie DNA]]
* [[Interakce DNA s proteiny]]
* [[Bakteriální chromozom]]
* [[Eukaryotické chromosomy]]
* [[DNA mitochondrií]]
{{Stručná biochemie (Štípek)}}
=== Zdroje ===
* {{Citace
| typ = kniha
| příjmení1 = Štípek
| jméno1 = Stanislav
| titul = Stručná biochemie
| podnázev = Uchování a exprese genetické informace
| vydavatel = Medprint
| vydání = 1
| rok = 1998
| rozsah = 92
| strany = 17–18
| isbn = 80-902036-2-0
}}
</noinclude>

[[Kategorie:Biochemie]]
[[Kategorie:Molekulární biologie]]
[[Kategorie:Genetika]]