Zobrazení zdroje stránky Uživatel:Tpmirchi/Biochemie

== Postup ==


Většinu stanovujeme tak, že analyt + něco nám dá barevný komplex, jehož absorbanci stanovujeme. Koncentraci analytu získáme de facto trojčlenkou – koncentrace standardu (znáte)/absorbance standardu (změříte) = koncentrace analytu (neznáte)/absorbance standardu (změříte)


Nezapomeňte, že absorbance se vždy měří proti něčemu – blanku aka slepému vzorku :) 



=== Stanovení koncentrace hemoglobinu v krvi ===

Oxidace hemoglobinu na methemoglobin:

HbFeII	+    	[FeIII(CN)6]3-	    →    	HbFeIII	+    	[FeII(CN)6]4-

	
Přeměna methemoglobinu na kyanmethemoglobin:

HbFeIII	+    	CN-	    →    	HbFeIIICN	


	
Oxidace dvojmocného železa v hemoglobinu hexakyanoželezitanem draselným na trojmocné železo. Vzniklý methemoglobin se s kyanidem draselným přemění na stálý kyanmethemoglobin s jediným širokým absorpčním maximem ve viditelné oblasti při 540 nm. Stanovení fotometricky.


==== Hodnocení ==== 
Referenční rozmezí pro dospělého muže je 130–180 g/l a pro ženu 120–160 g/l.

↑ Dehydratace

↓ Anemie


=== Stanovení koncentrace celkové bílkoviny v séru. ===

Stanovujeme '''biuretovou reakcí'''.
V alkalickém prostředí v přítomnosti měďnatých solí vytváří bílkoviny komplexní sloučeniny Cu2+ s ionty peptidových vazeb - fialové zbarvení → fotometrické stanovení v oblasti 540–560 nm. 
==== Hodnocení ====
Referenční rozmezí: Koncentrace celkové bílkoviny v séru (S-celková bílkovina): 65–85 g/l

↑ Dehydratace

↓ Selhání jater  


=== Stanovení koncentrace celkového bilirubinu v séru. ===


==== Hodnocení ====


=== Stanovení koncentrace triacylglycerolů v séru. ===


Několik po sobě jdoucích enzymových reakcí: 
* Lipoproteinová lipáza katalyzuje hydrolýzu triacylglycerolů na glycerol a mastné kyseliny.

* Uvolněný glycerol se převádí působením glycerolkinázy v přítomnosti ATP na glycerol-3-fosfát, který je pomocí glycerol-3-fosfátoxidázy oxidován na dihydroxyacetonfosfát.

* Současně vzniklý peroxid vodíku je využíván v další reakci katalyzované peroxidázou k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu. Vzniká chinoniminové barvivo, jehož absorbance se odečítá.
[[:Soubor:Stanovení cholesterolu.png|Schéma reakce zde]]

==== Hodnocení ====
Koncentrace triacylglycerolů v séru (fS-triacylglyceroly): 0,45–1,7 mmol/l

↑ Životní styl

↓ Nebývá - malnutrice?  


=== Stanovení koncentrace celkového cholesterolu v séru. ===

Několik enzymových reakcí:
* vlastnímu stanovení celkového cholesterolu předchází hydrolýza esterů cholesterolu na volný cholesterol a mastné kyseliny pomocí enzymu cholesterolesterázy (CE).
* Následuje oxidace neesterifikovaného cholesterolu na 4-cholesten-3-on za současného vzniku peroxidu vodíku v reakci katalyzované cholesteroloxidázou (CHOD).
* Poslední reakce využívá peroxidu vodíku k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu a fenolu v přítomnosti dalšího enzymu peroxidázy (POD). Vzniká barevný produkt, jehož absorbance je úměrná množství cholesterolu
[[:Soubor:Stanovení cholesterolu.png|Schema reakce zde]]

==== Hodnocení ==== 

Koncentrace celkového cholesterolu v séru (S-cholesterol celkový): 2,9–5,0 mmol/l

↑ Životní styl, diabetici, hypothyreoza - vysoký představuje riziko kardiovaskulárních onemocnění

↓ Malnutrice, hyperthyreóza  


=== Stanovení koncentrace močoviny v séru. ===

Při nepřímém stanovení je močovina nejprve působením enzymu '''ureasy''' katalyticky rozštěpena na oxid uhličitý a amoniak, který ve vodném prostředí přechází na amonný ion. Množství vzniklého amoniaku je poté stanoveno '''reakcí podle Berthelota'''. Amonný ion s chlornanem sodným a fenolem nebo salicylanem za katalýzy nitroprussidu sodného vytváří barevný produkt. Doporučená rutinní metoda využívá pro stanovení amonných iontů vzniklých v ureasové reakci přeměnu α-ketoglutarátu na glutamát. Reakce je katalyzována '''glutamátdehydrogensou''', která je spřažena s oxidací NADH na NAD+ (Warburgův optický test).

Schéma reakce zde:
 Reakce katalyzovaná ureázou:
 Močovina + H<sub>2</sub>O + 2 H<sup>+</sup> —→ 2 NH<sub>4</sub><sup>+</sup> + CO<sub>2</sub>

 Reakce katalyzovaná glutamátdehydrogenázou:
 2 NH<sub>4</sub><sup>+</sup> + 2-oxoglutarát + NADH + H<sup>+</sup> —→ L-glutamát + NAD<sup>+</sup> + H<sub>2</sub>O


[[Warburgův optický test|Warburgův optický test zde.]]
==== Hodnocení ==== 

Sérová koncentrace (S-urea): 1,7–8,3 mmol/l

↑ hypoperfuze ledvin

↓ nízký příjem bílkovin  


=== Stanovení koncentrace kyseliny močové v séru. ===
'''Nepřímé stanovení:''' enzym '''urikasa''', který přeměňuje kyselinu močovou na allantoin, '''peroxid vodíku''' a oxid uhličitý. Vzniklý peroxid vstupuje do spřažené reakce, katalyzované peroxidasou, při ní oxidační kopulací 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu vznikne chinoniminové barvivo, jehož intenzita zbarvení je úměrná koncentraci kyseliny močové ve vzorku.
 
(Při stanovení ruší kyselina askorbová. Proto je askorbátoxidasa v reakční směsi.)

[http://www.stefajir.cz/files/Prakticky_Zapocet_Biochemie.pdf Schéma reakce zde na str. 7]

==== Hodnocení ==== 
Koncentrace kyseliny močové v séru (fS-kyselina močová): ženy 120–340 μmol/l, muži 120–420 μmol/l

↑ vyšší příjem purinů ve stravě (maso, vnitřnosti, luštěniny), alkoholici, nižší odpad ledvinami

↓  nízký příjem purinů v potravě


=== Stanovení koncentrace glukózy v séru enzymaticky. ===
* enzym '''glukózaoxidáza''' katalyzuje  oxidaci  glukózy vzdušným kyslíkem za vzniku kyseliny glukonové, která přechází ve vnitřní ester  glukonolakton. Jako vedlejší produkt glukózaoxidázové reakce vzniká '''peroxidu vodíku'''
* V reakci katalyzované '''peroxidázou''' reaguje vznikající peroxid vodíku s 4-aminoantipyrinem, který se oxiduje na reaktivní meziprodukt, a ten s další látkou kopuluje na stálé rozpustné barvivo jehož absorbance se měří. 

==== Hodnocení ==== 

3,9–5,6 mmol/l nalačno a po jídle nižší než 10 mmol/l

↑ Diabetes

↓ 3 hodiny praktik chemie bez svačiny


=== Stanovení koncentrace vápníku v séru. ===

Spektrofotometrické měření '''barevných komplexů''', které vznikají reakcí komplexotvorných látek s kalciem. Např. o-kresolftalexon v alkalickém prostředí s vápenatými ionty poskytuje fialově zbarvený komplex, jehož intenzita zbarvení je úměrná koncentraci vápenatých iontů. Používá se též arsenaso-III
==== Hodnocení ==== 

Sérové kalcium: '''2,25–2,75''' mmol/l

Vyšší nebo nižší hodnoty mohou být důsledkem dysproteinémie.


=== Stanovení koncentrace železa v séru. ===

Reakce železa s komplexotvornou látkou.
* Uvolnění Fe3+ z vazby na transferin pomocí kyselin, např. HCl
* Redukce Fe3+ na Fe2+ kyselinou askorbovou
* Reakce Fe2+ s komplexotvorným činidlem ('''ferrozin''') obsahujícím reaktivní skupiny -N=C-C=N- za vzniku barevného komplexu

==== Hodnocení ====
↑ hemochromatóza, hemolýza

↓ krevní ztráty, narušená absorpce



=== Stanovení katalytické koncentrace ALT v séru. ===


==== Hodnocení ==== 



=== Stanovení katalytické koncentrace AST v séru. ===


==== Hodnocení ==== 


=== Stanovení katalytické koncentrace γ-glutamyltransferázy v séru. ===


==== Hodnocení ==== 


=== Stanovení katalytické koncentrace alkalické fosfatázy v séru. ===


==== Hodnocení ==== 


=== Spektrofotometrie mozkomíšního moku. ===


==== Hodnocení ====