Mikroskopie s fázovým kontrastem

Charakteristika

Většina světelných mikroskopů, které se používají pro zkoumání nejen biologických preparátů, umožňuje pozorování jen takových objektů, které v různé míře pohlcují procházející světlo – mění tedy amplitudu procházejícího elektromagnetického vlnění. Tyto objekty se nazývají amplitudové.

Existuje ale mnoho objektů, které po průchodu světla poskytují velmi malé nebo žádné rozdíly v absorpci světelného záření a jsou tedy pro pozorování v procházejícím světle nevhodné. Tyto preparáty ale kvůli různému indexu lomu v různých bodech mění fázi procházejícího světelného vlnění. Paprsky procházející preparátem se tedy liší fází světelné vlny. Takovéto objekty nazýváme fázové. Patří mezi ně většina nebarvených biologických preparátů.

Malé fázové rozdíly však naše oko není schopno rozeznat, a proto se nám fázové objekty jeví jako bezstrukturní a průhledné. Proto k jejich pozorování není běžný mikroskop vhodný. Pro jejich pozorování byl tedy vynalezen tzv. fázový mikroskop, který je schopen převést fázové změny na amplitudové, a tedy na změny lidským okem pozorovatelné. Umožňuje tak pozorování mnohých buněčných struktur, které byly před vynalezením fázového mikroskopu pozorovatelné až na mrtvých a nabarvených buňkách.

Fázový posuv závisí na vlnové délce záření zdroje, indexu lomu pozorovaného objektu, délce optické dráhy světla v pozorovaném objektu (tloušťka objektu).

schéma stavby fázového mikroskopu

Princip funkce

Obraz objektu v obrazovém ohnisku vzniká interferencí dvou vlnění. Vlnění přímého, které prochází preparátem beze změny, a vlnění difrakčního, které je fázovým objektem posunuté. Fázový posun těchto dvou vln je ale poměrně malý.

Přímé a difrakční vlnění můžeme oddělit tak, že do obrazového ohniska objektivu umístíme tzv. fázovou destičku, která má tvar prstence. Ta posune fázi přímého vlnění o hodnotu odpovídající čtvrtině vlnové délky.

Podle použité fázové destičky nám mohou vzniknout dva interferenční obrazy.

• Pozitivní fázový kontrast – fázová destička o optické tloušťce 3/4 vlnové délky posouvá fázi přímého vlnění o + 90°. Tlustší části preparátu se budou jevit tmavé, tenčí naopak světlé.

• Negativní fázový kontrast – fázová destička o optické tloušťce 1/4 vlnové délky posouvá fázi přímého vlnění o – 90°. Tlustší části preparátu se budou jevit světlé, tenčí naopak tmavé.

Význam

Používá se pro pozorování nezabarvených objektů, především struktur v živých buňkách, jako jsou jádro, jadérko, chromozómy a vakuoly. Může podstatně zvýšit kontrast také u slabě zabarvených a špatně rozlišitelných struktur histologických preparátů.

Historie

První fázový mikroskop vynalezl holandský fyzik Frederik Zernike roku 1935 a použil metodu fázového kontrastu.

Odkazy

Zdroj

• http://www.sci.muni.cz/kfar/html/fazovy_kontrast.pdf
• http://xarquon.jcu.cz/edu/zbb/fazovyk.pdf
• https://en.wikipedia.org/wiki/Phase_contrast_microscopy

Použitá literatura

• HEJTMÁNEK, Milan. Úvod do světelné mikroskopie. 3. vydání. Olomouc : Univerzita Palackého, 1993. ISBN 8070673087.

• PROSSER, Václav, et al. Experimentální metody biofyziky. 1. vydání. Praha : Academia, 1989. ISBN 80-200-0059-3.

• Smékal, Petr.Experimentální metody biofyziky II. Ostravská universita 1995, Nová Huť