Polymorfismus konformace jednoduchých řetězců: Porovnání verzí
m (+kat) |
m (nadpisy; členění) |
||
| Řádek 1: | Řádek 1: | ||
==Vyhledávání mutací== | |||
Několik metod. Mezi '''nejjednodušš'''í patří technika označovaná '''SSCP''' (single strand conformation polymorphism, '''polymorfismus konformace jednořetězcové DNA'''). Jejím principem je elektroforéza jednovláknové DNA na nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu při nízké teplotě. Řetězec DNA se „sbalí“ podle vnitřních komplementarit, čímž vznikne prostorová struktura podobná např. tRNA. Rychlost, jakou pak jednořetězcová DNA putuje během [[elektroforéza nukleových kyselin | elektroforézy]], závisí na přesné konformaci. Protože i velmi malá změna v sekvenci nukleotidů může způsobit, že DNA vytvoří úplně jinou prostorovou strukturu, je možné pomocí SSCP '''odlišit často i záměnu jediné báze'''. Uvádí se, že při práci s úsekem DNA dlouhým 100 – 300 bp lze pomocí SSCP zachytit 99 % bodových mutací, pro úseky dlouhé 400 bp více než 80 %. S rostoucí délkou vyšetřovaného fragmentu DNA účinnost SSCP klesá a pro úseky delší než asi 750 bp není tato technika vhodná. | |||
Při práci s většinou [[polymerasová řetězová reakce | PCR]] produktů se DNA během SSCP rozdělí do dvou skupin frakcí | Při práci s většinou [[polymerasová řetězová reakce | PCR]] produktů se DNA během SSCP rozdělí do dvou skupin frakcí: | ||
*První skupina putuje pomaleji, proužky bývají ostřejší a bývá jich větší počet. | |||
*Druhá frakce putuje rychle a zpravidla tvoří jediný pruh. | |||
Důvodů, proč jeden PCR produkt tvoří několik proužků, je několik: | |||
* každý řetězec denaturované DNA zaujme jinou konformaci, | * každý řetězec denaturované DNA zaujme jinou konformaci, | ||
* jeden řetězec může tvořit více stabilních konformací, | * jeden řetězec může tvořit více stabilních konformací, | ||
* část molekul nevytvoří sbalenou prostorovou strukturu, | * část molekul nevytvoří sbalenou prostorovou strukturu, | ||
* část molekul renaturuje do původní dvoušroubovice a vzniknou tak znovu homoduplexy, | * část molekul renaturuje do původní dvoušroubovice a vzniknou tak znovu homoduplexy, | ||
* u [[heterozygot]]ů může část molekul renaturovat za tvorby heteroduplexů. | * u [[heterozygot]]ů může část molekul renaturovat za tvorby heteroduplexů. | ||
==Odkazy== | |||
===Související články=== | |||
=== Zdroj === | |||
[[Kategorie:Molekulární biologie]] | [[Kategorie:Molekulární biologie]] | ||
Verze z 14. 1. 2011, 21:19
Vyhledávání mutací
Několik metod. Mezi nejjednodušší patří technika označovaná SSCP (single strand conformation polymorphism, polymorfismus konformace jednořetězcové DNA). Jejím principem je elektroforéza jednovláknové DNA na nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu při nízké teplotě. Řetězec DNA se „sbalí“ podle vnitřních komplementarit, čímž vznikne prostorová struktura podobná např. tRNA. Rychlost, jakou pak jednořetězcová DNA putuje během elektroforézy, závisí na přesné konformaci. Protože i velmi malá změna v sekvenci nukleotidů může způsobit, že DNA vytvoří úplně jinou prostorovou strukturu, je možné pomocí SSCP odlišit často i záměnu jediné báze. Uvádí se, že při práci s úsekem DNA dlouhým 100 – 300 bp lze pomocí SSCP zachytit 99 % bodových mutací, pro úseky dlouhé 400 bp více než 80 %. S rostoucí délkou vyšetřovaného fragmentu DNA účinnost SSCP klesá a pro úseky delší než asi 750 bp není tato technika vhodná.
Při práci s většinou PCR produktů se DNA během SSCP rozdělí do dvou skupin frakcí:
- První skupina putuje pomaleji, proužky bývají ostřejší a bývá jich větší počet.
- Druhá frakce putuje rychle a zpravidla tvoří jediný pruh.
Důvodů, proč jeden PCR produkt tvoří několik proužků, je několik:
- každý řetězec denaturované DNA zaujme jinou konformaci,
- jeden řetězec může tvořit více stabilních konformací,
- část molekul nevytvoří sbalenou prostorovou strukturu,
- část molekul renaturuje do původní dvoušroubovice a vzniknou tak znovu homoduplexy,
- u heterozygotů může část molekul renaturovat za tvorby heteroduplexů.
